分子生物学と免疫学の融合技術,イムノPCR法の開発と超微量定量への応用

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07807211
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 遠藤 浩 岡山大学, 医療技術短期大学部, 教授 (70033090)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森 秀治 岡山大学, 医療技術短期大学部, 助手 (50220009)
• Keywords: イムノPCR / イムノアッセイ / C反応性タンパク質

Research Abstract

抗体が持つ特異的結合能を巧みに応用した微量測定系は,イムノアッセイと称され医学・生物学の領域に広く浸透し,今日のバイオ技術を支える重要な手段となっている。しかしながら,従来の発色酵素や放射性同位体を用いた検出系では,フェムトモル(1×10^<-15>モル)濃度を検出限界とし,その濃度以下の物質の定量や検出を行うことは不可能であった。本研究では,近年,著しい勢いで発展して来たPCR法と言われる分子生物学的新技術をイムノアッセイの検出系に導入し,抗原抗体反応が示す特異性とPCR法が持つ優れた感度を併せ持った超高感度測定系(イムノPCR法)の構築を試みた。測定のモデル物質としてC反応性タンパク質を用いて検討を行った結果,以下のことが明らかとなった。
1,Ca^<2+>依存的にホスホリルコリンに結合する性質を利用して,測定対象(C反応性タンパク質)をプレートに固相化した。ブロッキング後,抗C反応性タンパク質抗体,ビオチン化二次抗体,ならびにテンプレートであるビオチン化pCRIIプラスミドDNA断片-アビジン複合体を順に反応させた。最後に,特異的プライマー(SP6及びT7プロモータープライマー)を用いてPCR反応を行ったところ,固相化したC反応性タンパク質濃度に依存してPCR産物(497bp)の特異的な増大が認められた。
2,PCR産物をエチジウムブロマイド染色後,個々の蛍光強度を見積もることによって,標準曲線を得ることができた。
3,PCR産物量は,反応サイクルや温度,アニーリング時間などのパラメータに依存して変化した。
4,ペルオキシダーゼや耐熱性ホスファターゼを発色酵素として用いた従来の比色法によるイムノアッセイの検出限界が約50ng/mlであったのに対して,本測定系はその数十倍高い感度を示した。

Research Products

• [Publications] Shuji Mori: "Affinity purification and characterization of thermostable alkaline phosphatase from Bacillus stearothermophilus." Life Sciences. (発表予定). (1997)
• [Publications] 森秀治: "疎水性クロマトグラフィに伴う耐熱性ホスファターゼ活性の変動" 岡山大学医療技術短期大学部紀要. 7・1. 17-21 (1996)
• [Publications] Motoi Okamoto: "A enzyme-linked immunosorbent assay for heparan sulfate proteoglycan." Life Sciences. (発表予定). (1997)