個体へのcDNA導入・発現系を用いた神経関連遺伝子の検索

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07808078
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 高木 新 名古屋大学, 理学部, 助教授 (90171420)
• Keywords: C-elegans / 神経 / cDNA

Research Abstract

1)cDNA合成
C.el egansの各発生段階を含む集団からpolyA+RNAを抽出した。これを鋳型にoligo-dTをプライマーとしてcDNAを合成し、このcDNAをSL1(線虫で最も頻繁に使われるspliced leader)配列とoligo-dTをプライマーとしてPCRを行ったところ,20k-500bpにかけてスメア状にPCR産物ができた。これらは非特異的産物と考えられたため、次にoligo-dTにタグ配列をつけたプライマーを用いてcDNAを合成し、SL1とタグ配列をプライマーとしてPCRを行ったところ2.5k-300bpにかけてスメア状に産物が検出された。 これはcDNAの分布範囲とはほぼ対応していた。このPCR産物をクローニングしたところ、非特異的に増幅された産物も存在したが、プライマーに依存した産物も含まれていた。プライマーに依存した合成産物は500bpのものが多かった。
2)発現用ベクター
当初、神経組織特異的発現用に予定していたunc-31遺伝子の5'上流域は長すぎてライブラリー用のベクターとして扱いにくいなど、不都合があることが明らかになった。そこで、ベクターに用いる適当な神経特異発現調製領域をプロモータートラップ法によって検索することにし、いくつか候補を得た。また、遺伝研、石原健博士より神経系特異発現を示すプロモーターを含むプラスミドを戴いた。これらのプラスミドに適当な制限酵素部位を導入し発現用ベクターを構築中である。