新しいスクリーニング法を用いたタンパク質リン酸化・脱リン酸化の調節機構の解明

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07857012
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 小林 孝安 東北大学, 加齢医学研究所, 助手 (10221970)
• Keywords: プロティンホスファターゼ2C / タンパク質の相互作用

Research Abstract

哺乳類のタンパク質ホスファターゼ2C型(以下PP2Cと略す)を大腸菌で過剰発現させると、おそらく大腸菌の2-コンポーネントシステムで重要なヒスチジン残基が脱リン酸化されるために生育が著しく阻害される。本研究の目的は、この性質を利用してtwo-hybridsystemに代わる相互作用タンパク質の新しいスクリーニング法を開発することである。しかしながら、実際に試みてみた結果、本法に関して次のような問題点があることが分った。
(1)本法は過剰発現させたPP2Cによる阻害作用を抑圧するような第二の遺伝子を導入することによってPP2Cを生理的に阻害しているタンパク質を見いだそうとするものであった。しかしながらPP2Cを大腸菌で発現された場合、大部分のtransformantの生育は阻害されるもののある頻度で生育が阻害されずコロニーを形成するようなものが出てきてしまった。従って本法が円滑に施行されるためには完全にコロニー形成が抑制されるような宿主の選択が必要と考えられる。
(2)第二の問題点は、宿主として組み換え不能なrecA株を用いているにも関わらず、第二のプラスミドを導入したのちに、あらかじめ導入しておいた発現ベクターとの間で組み換えを起こしてしまう点にある。その結果PP2Cの発現量が低下してコロニーを形成し、偽のコロニーを形成してしまうことが分かった。この場合も第一の問題点と同様、宿主の育成とともに適切なプラスミドの設計が不可欠である。
以上の問題点を克服すべくさらに検討を進めている。

Research Products

• [Publications] S. Kato 他: "Molecular cloning and expression of mouse Mg^<2+>-dependent protein phosphatase β-4" Arch. Biochem. Biophys.318. 387-393 (1995)
• [Publications] N. Yokoyama 他: "PP2C phosphatase activity is coupled to cAMP- mediated pathway in ratparotid acinar cells." Biochem. Mol. Biol. Internatl.36. 845-853 (1995)
• [Publications] M. Nishikawa 他: "Up-regulation of protein serine/threonine phosphatase type 2C during 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-induced monocytic differentiation of leukemic HL-60 cells." FEBS Lett.375. 299-303 (1995)
• [Publications] T. Kobayashi 他: "Enhanced UV sensitivity of yeast cells induced by overexpression of Mg^<2+>-dependent protein phosphatase a(type 2Cα)" Mutation Res.(印刷中).
• [Publications] M. Ohnishi.他: "Localization of the mouse protein serine/threonine phosphatase 2Cβ gene to chromosome 17E4-5." Genomics. (印刷中).