2007 Fiscal Year Annual Research Report
セリウム触媒を利用した人工制限酵素の高機能化および遺伝子操作への応用
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07J03030
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
愛場 雄一郎 The University of Tokyo, 大学院・工学系研究科, 特別研究員(DC1) (10581085)
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| Keywords | DNA / セリウム(IV) / 位置選択的切断 / 遺伝子組換え / 制限酵素 |
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| Research Abstract |
DNAを位置選択的に切断する技術は、バイオテクノロジーにおいて必要不可欠である。しかし一般的な天然制限酵素は、切断可能な位置が限定、巨大なDNAに対して十分な選択性を持たない。これに対し我々はCe(IV)/EDTAとPNAを併用した人工制限酵素の構築に成功している。本系は天然を超える高い位置特異性と自由度を有するが、切断効率の面では改良の余地があった。本研究では、切断効率・選択性をより向上させた次世代の人工制限酵素の構築を目指す。
これまで、Ce(IV)/EDTAと強く相互作用する配位子(リン酸基など)をPNA末端に導入し、ターゲット部位近傍にCe(IV)/EDTAを濃縮させることで、切断効率を向上させることに成功している。そこで、より強い相互作用が期待される複数のリン酸基からなるEDTP配位子を合成し、さらなる切断効率の向上を目指した。まず設計の簡便な1本鎖切断系においてEDTP配位子を導入し評価を行い、また実際に長鎖1本鎖DNAを位置選択的に切断し、遺伝子組換えの応用を試みた。今回用いたBFP,GFP遺伝子では、蛍光発色団形成に関わるアミノ酸2残基のみが異なっているので、そこを切断のターゲットとした。基質1本鎖DNA(840mer)はBFPから、またGFPの下流を非対称PCRにより増幅した(異なるアミノ酸2残基は下流のGFP側に含む)。切断時には、従来のリン酸基に比べ非常に高い効率で切断が確認できた。相補鎖DNAを用いてBFP切断断片とGFP外来遺伝子をリガーゼにより連結した。定法に従い大腸菌にて発現させたところ、GFP由来の緑色蛍光が確認され、シークエンサーからも目的の組換え体が調製されたことが確認できた。
以上から、本系におけるEDTP配位子の有用性が実証され、本系をより高効率化する足がかりを得た。今後はさらに本系に改良を加え、ツールとしての完成を目指したいと思う。
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