2009 Fiscal Year Annual Research Report
セリウム触媒を利用した人工制限酵素の高機能化および遺伝子操作への応用
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07J03030
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
愛場 雄一郎 The University of Tokyo, 大学院・工学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | DNA / セリウム(IV) / 位置選択的切断 / 遺伝子組換え / 制限酵素 / PNA / 加水分解 |
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| Research Abstract |
遺伝子組換え技術は、遺伝子の本体であるDNAを位置選択的に切断し、他の遺伝子と連結することで達成される。しかし、DNA切断に用いられる天然制限酵素は、切断位置が限定されたり、選択性が不十分であったりと、ゲノムなどの巨大DNAを扱うツールとしては不十分であった。これに対し我々は、DNA加水分解触媒Ce(IV)/EDTAとPNA(ペプチド核酸)を併用し、天然を超える高い位置特異性と自由度を有した人工制限酵素の構築を行ってきた。
本研究では、さらに高度な遺伝子操作に向けた汎用的なツールとして完成させるべく、切断効率・選択性をより向上させた次世代の人工制限酵素の構築を目指した。今年度は、DNA配列認識部位であるPNAにリンカーを導入し、その認識能が配列全体として向上していることを明らかにした(投稿作業中)。さらに本系を発展させ、機能性リンカーを用いたPNAへの新機能付与にも成功した(論文1、2)。また、EDTP配位子とCeとの相互作用を利用して切断効率の大幅な向上に成功し、その切断機構の解明も行った(論文3)。
現在は、PNAへの配位子修飾へと展開が行われている。EDTP以外にもCeとの強い相互作用を示すポリアミン系錯体のPNA導入に成功し、切断の高効率化が確認されており、今後のさらなる展開が期待される。
上記の結果はいずれも、本系を次世代の遺伝子操作ツールとして今後展開していく上で非常に重要な知見である。巨大DNAを対象とし長鎖PNAを用いる場合では、複数のリンカーを導入してミスマッチ識別能を向上させたり、EDTPなどの配位子を修飾したPNAを用いたりすることで、さらなる切断効率の向上が期待される。このように本人工制限酵素をさらに発展させ、より高い活性・選択性でDNAを位置選択的に切断する技術が確立されることで、従来は達成が困難であった遺伝子操作などへの応用が期待される。
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