呼吸鎖複合体チトクロムbc_1の構造と機能:X線結晶解析と分子遺伝学解析の統合

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08044203
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 福山 恵一 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80032283)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大岡 宏造 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (30201966) ; 高橋 康弘 大阪大学, 大学院・理学研究科, 講師 (10154874) ; 佐伯 和彦 大阪大学, 大学院・理学研究科, 講師 (40201511) ; FEVZI Daldal Univ. of Pennsylvania Dept. of Biology, Professor
• Keywords: 電子伝達系 / 膜蛋白質複合体 / 分子標識 / Rhodobacter / 鉄硫黄センター / チトクロム

Research Abstract

呼吸鎖電子伝達系複合体における電子伝達に伴うプロトン濃度勾配の形成は,生物のエネルギー獲得の重要なプロセスである。光合成細菌チトクロムbc_1複合体は、真核生物のミトコンドリアのものと比べ単純な構造を持つが、反応機構は相同と考えられている。本年度の実績は以下の通り。
1) Rhodobactercapsulatusチトクロムbc_1複合体の分子標識付加体の精製法の改良:昨年度までに、チトクロムbc_1複合体を迅速・高収量で精製するために、Rieske蛋白質とチトクロムc_1の2種のサブユニットのC末端にHis6残基を付加する改変体を作製した。Ni-カラム、イオン交換カラムとゲルろ過カラムを用いた3段階の精製で得た標品はほぼ純粋であったが、精製中にヘムbと鉄硫黄クラスター含量の低下が認められた。Ni-カラム・クロマトグラフイのステップにおける、洗浄溶出用緩衝液のpHを上げイミダゾール濃度を下げることにより、1複合体当たりのヘムb含量をほぼ2、鉄硫黄クラスター含量をほぼ1とすることができた。
2) 分子標識付加チトクロムbc_1複合体の分光学解析:クロマトフォア膜中の2種のHiS配列付加チトクロムbcl複合体の酵素化学的性質を、フラッシュ照射により解析した。その結果、Rieske蛋白質とチトクロムc_1それぞれのC末端にHis6残基を付加した複合体のターンオーバーは、野生型の約70%と約90%であった。
3) 分子標識付加R.capsulatusチトクロムbc_1複合体の結晶化・結晶解析:2種の迅速精製標品のうちRieske蛋白質にHis6残基を付加したものについては、昨年度得られた微結晶の成長条件を検討したが、未だx線解析を行うのに十分な大きさのものは得られていない。