1998 Fiscal Year Annual Research Report
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08044204
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
杉野 明雄 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (90231737)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
JOHNSTON Lel National Institute for Medical Research, 主任
DIFFLEY John Inperial Cancer Research Fund The Clare, 主任
CAMPBELL Jud California Institute of Technology Biolo, 教授
TYE BikーKwoo Cornell University, Section of Biochemist, 教授
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| Keywords | 出芽酵母 / 染色体DNA複製 / 複製ライセンス因子 / Mcm蛋白群 / 複製開始因子 / ORC / Dbf-Cdc7複合体 / DNAポリメラーゼ |
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| Research Abstract |
出芽酵母(S.cercvisiae)の染色体DNA複製開始の制御にCdc7/Dbf4 protein kinase複合体が必須である。CDC7及びDBF4を組込んだバキュロウイルス感染昆虫細胞SF-9よりCdc7/Dbr4複合体を精製し、DNA複製ライセンス因子であるMcm蛋白群のMcm2が特異的にリン酸化されることを明かにした。更に、cdc7-1またはdbf4-1を組込んだバキュロウイルス感染細胞より精製したCdc7-1/Dbf4またはCdc7/Dbf4-1複合体は、Mam2をリン酸化することができないことが明らかになり、Mcm蛋白群が細胞内でCdc7/Dbf4 protein kinaseの基質となっていることを強く示唆した。一方、MASSスペクトロ法を用いてMcm2のCdc7/Dbf4複合体によるin vitroリン酸化部位を決定した。新たに染色体DNA複製開始に関与する遺伝子産物としてMcm10を同定、精製し、この産物が特異的に1本鎖DNAに吸着する性質を持っていることが明かになった。またmcml0-1変異株に於ける染色体DNA複製開始反応が高温下では複製フォークの進行が1方向だけ特異的に阻害されていることを明かにした。 また、mcm10-1変異と合成致死になる変異をして単離した一つがdna2であることが明らかになった。更に、蛍光抗体法を用いて、Mcm10蛋白の細胞内局在をしらべた。その結果、Mcm10蛋白は主に核マトリックスに局在し、複製開始部位に結合し複製開始に関与しているORC蛋白複合体と結合していることが明らかになった。
Leading鎖合成の主役をなしていると考えられるDNAポリメラーゼε複合体と相互作用していると考えられる蛋白を同定する目的でdpb2-1及びdpbll-1変異と合成致死となる変異を単離した。その結果、Sld2,Sld3,Cdc45,SId5,Rad53蛋白が直接的または、間接的にDNAポリメラーゼεと相互作用していることを明らかにした。このうちdpb11-1,sld2-6,cdc45,sld3-1,sld5-1温度感受性変異株では染色体DNA複製開始反応が温度感受性になっていることからDNAポリメラーゼεを始めとしてこれらの遺伝子産物が複製開始反応に重要な働きをしていることが明らかになった。
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[Publications] Noskov,V.N.: "The RFC2 gene encoding the third largest subunit of the RFC complex is required for chromosomal DNA replication and cell cycle check point in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Mol.Cell.Biol.18. 4914-4923 (1998)
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[Publications] Maki,S.: "DNA polymerase II(ε) of Saccharamyces cerevisiae dissociates from the DNA template by sensing single-stranded DNA." J.Biol.Chem.273. 21332-213141 (1998)
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[Publications] Sugino,A.: "DNA polymerase ε of S.pombe encoded by cdc20+ is ewquired for chromosomal DNA replication." Genes to Cells.3. 99-110 (1998)
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[Publications] Kamimura,Y.: "Sld2,which interacts with Dpb11 in Saccharomyces cerevisiae, is required for chromosomal DNA replication." 18. 6102-6109 (1998)
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[Publications] Kamimura,Y.: "DNA helicase III of Saccharamyces cerevisiae, encoded by YER176w(HEL1),highly unwinds covalently closed, circular DNA in the presence of a DNA topoisomerase and yRF-A." J.Biochem.125. 236-244 (1999)
