1997 Fiscal Year Annual Research Report
植物プロテアーゼの細胞内輸送及び翻訳後プロセシングの分子機構
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08044217
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| Research Institution | TOKYO METROPOLITAN UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
南川 隆雄 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (30087001)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
GALILI Gad アメリカ農務省, ベルツヴィル農業センター, 研究員
HERMAN Eliot アメリカ農務省, ベルツヴィル農業センター, 室長
岡本 龍史 東京都立大学, 大学院・理学研究科, 助手 (50285095)
山内 大輔 東京都立大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40220222)
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| Keywords | プロテアーゼ / 細胞内輸送 / プロセシング / 小胞体 / 液胞 / 免疫電顕法 / 昆虫培養細胞 / アミノ酸配列 |
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| Research Abstract |
標記の課題につき生化学・分子生物学および細胞生物学的な研究を行い、次の結果を得た。
1.免疫電子顕微鏡法により、SH-EPは小胞体からゴルジ体を経て液胞に輸送されることが示された。またこの際、超薄切片の作製が困難とされるデンプン性種子の固定・脱水・包埋法を確立した。
2.SH-EPのC末端プロペプチド中に存在するKDEL配列の機能を解析するために、KDEL配列をもつSH-EP(KDEL+SH-EP)とそれを欠失させたSH-EP(KDEL-SH-EP)を、バキュロウイルスを介してカイコ由来の昆虫培養細胞(Sf9)でそれぞれ発現させた。感染後のKDEL+SH-EPとKDEL-SH-EPの発現を経時的に調べた結果、KDEL+SH-EPとKDEL-SH-EPはともにSf9細胞中においてケツルアズキ子葉中で見られるプロセシングと類似したプロセシングをうけたが、KDEL+SH-EPのプロセシングはKDEL-SH-EPのそれよりも遅れて観察された。また、KDEL配列を特異的に認識する抗体を用いた解析およびショ糖密度勾配遠心法により、KDEL配列を含むC末端プロペプチドは小胞体内で切除され、その結果、SH-EPが小胞体から液胞へと輸送され始めることが示唆された。さらに、活性中心のCysをGlyに置換したSH-EPを同様に解析した結果、C末端プロペプチドの切除が観察されたことから、小胞体内腔におけるC末端プロセシングは自己切断反応によるものではないことが示された。また、免疫組織化学法により、Sf9細胞においてSH-EPはKDEL配列の有無にかかわらず主にリソソームに局在することが明らかになった。これらの結果より、SH-EPのC末端KDEL配列はSH-EPを小胞体内腔に「一時的な前駆体(中間体)」として保持する機能を持ち、その配列は小胞体に局在するプロテアーゼにより切除されることが推定された。
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[Publications] A.Shintani, H.Kato and T.Minamikawa: "Hormonal regulation of expression of two cysteine endopeptidase genes in rice seedlings." Plant Cell Physiol.38(11). 1242-1248 (1997)
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[Publications] Kim, J.W.and Minamikawa, T: "Expression and characterization of endopeptidase in suspension-cultured cells of French bean." Biosci.Biotech・Biochem.61(1). 113-117 (1997)
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[Publications] Okamoto, T.and.Minamikawa, T.: "A vacuolar cysteine endopeptidase (SH-EP) that digests seed storage globulin characterization,regulation of gene expression,and posttranslational processing." J.Plant Physiol.(印刷中).
