フィラリア制圧薬の開発を目的としたフィラリア・プロテアーゼとその阻害剤の研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08044222
• Research Institution: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• Principal Investigator: 高橋 健治 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (70011533)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): DISSANAYAKE セナラッツ. ハーバード大学, 公衆衛生学部, 研究員 ; WIMALASIRI W ペラデニヤ大学, 医学部, 講師 ; ATHAUDA Sena ペラデニヤ大学, 医学部, 講師 ; 小島 正樹 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (90277252) ; 井上 英史 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (20184765)
• Keywords: フィラリア / プロテアーゼ / cDNAライブラリー / PCR / クローニング

Research Abstract

1.ウシ・フィラリア(Seteria digitata)をスリランカにおいて採集した。その約50gを用いプロテアーゼの精製を進めた。まず、相抽出液をDEAE-セルロースクロマドグラフィーにより未吸着画分および吸着画分に分けた。前者はペプスタケン・セファロースカラムに吸着、溶離後、モノQカラムによるクロマトグラフィー(FPLC)で分画し、酸性プロテアーゼ標品を精製した。後者はDEAE-セルロース 0〜1M Naclグラジエントで溶出する活性分画について、セファロースS-200カラム,ついでペプスタチン・セファロース,FPLC(モノQ)の順で精製し、ほぼ純粋な酸性プロテアーゼを得た。これらの精製酵素について種々の性状と部分アミノ酸配列の解析を行った。中性プロテアーゼは活性が低く、精製は部分精製に止どまった。
2.ヒト・フィラリア(Brugia malayi)成虫0.4gよりmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製した。また、一般的なアスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ(キモトリプシン型)、およびシステインプロテアーゼの主に活性部位残基を含む領域の一次構造に基づき、各種のDNAプライマーを調製した。これらのプライマーを用い、PCR法によりDNAの増幅を行い、電気泳動により反応産物を解析した。この結果、いくつかのプロテアーゼに相当するcDNA断片が増幅されていることが判明した。今後は、これらのcDNAをプローブに用い、各プロテアーゼのcDNAのクローニングを行い、その塩基配列分析から一次構造を推定する予定である。
3.Brugia malayi cDNAのほか、Onchocerca volvulus cDNA,Brugia pahangi幼虫cDNA,Wuchereria bancrofti ミクロフィラリア遺伝子DNAおよびBrugia malayi遺伝子DNAの各ライブラリーを調製した。

Research Products

• [Publications] Gwang-Ho Jeohn: "Specific cleavage of the Gln^<15>-Lys^<16>bond in β-amyloid peptides by porcine vasoactive intestinal polypeptide-degrading endopeptidase" Protein and Peptide Letters. 3. 101-106 (1996)
• [Publications] Naohisa Yahagi: "Complementary DNA cloning and seguencing of rat enteropeptidase and tissue distribution of its mRNA" Biochemical and Biophysical Research Communications. 219. 806-812 (1996)
• [Publications] Ken-ichi Hatano: "Solution structure of bromelain inhibitor VI from pineapple stem : structural similarity with Bowman-Birkfrypsin/chymotrypsin inhibitor from soybean" Biochemistry. 35. 5379-5384 (1996)
• [Publications] Hideshi Inoue: "Heterologous expression and site-directed mutagenesis studies on the activation mechanism and the roles of the basic residues in the prosegment of aspergills pepsinogen I" European Journal of Biochemistry. 237. 719-725 (1996)
• [Publications] Ken-ichi /Hatano: "Tertiary structure comparison of bromelain inhibitor VI from pineapple stem with bovine pancreatic typsin inhibitor" Proceedings of the Japan Academy. 72. 104-107 (1996)
• [Publications] Akira Hirasawa: "Purification and characterization of turtle pepsinogen and pepsin" Journal of Biochemistry. 120. 407-414 (1996)
• [Publications] Masao Tanji: "The primary structure of the major pepsinogen from the gastric mucosa of tuna stomach" Journal of Biochemistry. 120. 647-656 (1996)
• [Publications] Yasuko Sakurai: "Trypsin-like endopeptidase(s) naturally entrapped in human blood α2-macroglobulin" Biomedical Research. 17. 347-350 (1996)
• [Publications] Takayuki Takahashi: "Prolyl endopeptidase from the fullicular ftuid of porcineovary : comparison with the liver enzyml" Biomedical Research. 17. 435-442 (1996)
• [Publications] Hee-Jung Kim: "Purification and characterization of an extracellular metalloprotease from pseudomonas fluoresens" Journal of Biochemistry. 121. 82-88 (1997)
• [Publications] Kenji Takahashi: "The specificity of peptide bond cleavage of acid proteinase A from Aspergillus niger var.macrosporus toward oxidized ribonuclease A" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 61. 381-383 (1997)
• [Publications] Hidemi Matsuzaki: "Evidence for the identity of rat liver microsomal membrane-bound serine proteinase with hepsin" Protein and Peptide Letters. 4(in press). (1997)
• [Publications] Kenji Takahashi: "Restriction of of specificities of trypsin and α-chymotrypsin at a high alraline pH value" Protein and Peptide Letters. 4(in press). (1997)