フィラリア制圧薬の開発を目的としたフィラリア・プロテアーゼとその阻害剤の研究

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08044222
• Research Institution: Tokyo University of Pharmacy and Life Science
• Principal Investigator: 高橋 健治 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (70011533)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): SENARATH Dis ハーバード大学, 公衆衛生学部, 研究員 ; WEELAPPULI R ペラデニア大学, 医学部, 講師 ; SENARATH B.P ペラデニア大学, 医学部, 講師 ; 小島 正樹 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (90277252) ; 井上 英史 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (20184765)
• Keywords: フィラリアプロテアーゼ / Brugia malayi / アスパラギン酸プロテアーゼ / システインプロテアーゼ / カテプシンロ / ガストリックシン / カテプシンS / クローニング

Research Abstract

1.Brugia malayiの成無視のcDNAライブラリーより2種のアスパラギン酸をプロテアーゼ(Asp1、Asp3),幼虫より1種のアスパラギン酸プロテアーゼのcDNAをクローン化し,Asp2,Asp3については全長,Asp1については部分長の塩基配列を決定し,アミノ酸配列を推定した。いずれも典型的なペプシン型アスパラギン酸プロテアーゼであり,Asp1とAsp2はカテプシンDに近く,Asp3はガストリックシンに近い酵素で,両者は進化的に別系統に属することが明らかになった.大腸菌等を用いる本控訴の大量発現系の構築を進めた.
2.Brugia malayiの幼虫cDNAライブラリーより2種のシステインプロテアーゼcDNAをクローン化し,その全長配列を決定し,アミノ酸配列を推定した.両者のアミノ酸配列はかなり異なるか同種のシステインプロテアーゼに属し、高等動物のカテプシンSに高い相同性を示した.
3.上記研究を並行して、プロテアーゼに関する以下の研究を行った.
(1)マウスカテプシンE遺伝子を単離し、全塩基配列と染色体上の位置を明らかにした.
(2)パイチャップルのブロメラインインヒビターの各種イソ型の全アミノ酸配列を決定した.
(3)アスパラギロペプシノゲンIのプロペプチド中の塩基性残基の役割を部位特異的変異法により解析した.
(4)アスパラギロペプシンIIの活性部位残基(AspとGlu)を部位特異的変異方により同定した.
(5)食虫植物よりネペンテシンを初めて完全精製し,その諸性状を明らかとした.
(6)ブタ脳より活性発現に界面活性剤を必要とする新規な膜統合性金属プロテアーゼを発現,精製,単離し,諸性状を明らかにした.
(7)ブタ小腸粘膜よりエンテロペプチダーゼを精製する方法を確立し,精製酵素について諸性状を明らかにした.

Research Products

• [Publications] Satoshi Yonezawa: "Cathepsin E Gene in Mouse" Biomedical Research. 19. 327-334 (1998)
• [Publications] Ken-ichi Hatano: "The Amino Acid Sequence of Isoforms of the Bromelain Inhibitor from Pineapple Stem" Journal of Biochemistry. 124. 457-461 (1998)
• [Publications] Hideshi Inoue: "The Roles of the Basic Residues in the Prosegment of Aspergillopepsinogen I" Advances in Experimental Medicine and Biology. 436. 239-244 (1998)
• [Publications] Kenji Takahashi: "Aspergillus niger Acid Proteinase A.Structure and Function" Advances in Experimental Medicine and Biology. 436. 275-282 (1998)
• [Publications] Senarath B.P.Athauda: "Acid Proteinase from Nepenthes distillatoria(BADURA)" Advances in Experimental Medicine and Biology. 436. 453-458 (1998)
• [Publications] Gwang-Ho Jeohn: "Purification and Characterization of a Detergent-requiring Membrane-bound Metallsandopeptidose from Porcine Brain" European Journal of Biochemistry. 259. 1-8 (1999)
• [Publications] Masashi Matsushima: "Purification and Further Charactarization of Enteropeptidase from Porcine Duodenum" Journal of Biochemistry. 125(in press). (1999)