甲状腺ホルモンレセプターの生体内リン酸化の機序及びその機能の解明に関する共同研究。

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08044231
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 菅原 明 東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (90270834)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): YEN Paul M. ハーバード医科大学, 内科, 講師 ; SACKS David ハーバード医科大学, 病理, 助教授 ; CHIN William ハーバード医科大学, 内科, 教授
• Keywords: 甲状腺ホルモン / レセプター / リン酸化 / カゼインキナーゼII / 転写調節

Research Abstract

甲状腺ホルモンレセプター(TR)の生体内におけるリン酸化の機序を明らかにする目的で以下の実験を行った。Cos-1細胞にTRβ cDNA発現プラスミドをトランスフェクションして細胞内でTRβを発現させた後、細胞にオカダ酸の存在下で^<32>P-正リン酸を添加することにより生体内リン酸化を行った。細胞抽出液をCheng博士(NIH)より供与された抗TRβモノクローナル抗体と反応させることによって、リン酸化TRβの免疫沈降を行った。回収されたリン酸化TRβをトリプシンにより消化した後に二次元電気泳動を行い、TRβの生体内リン酸化のパターンを確認した。さらに、大腸菌にて発現されたTRβタンパクをカゼインキナーゼII(CKII)を用いてin vitroリン酸化した後に、生体内リン酸化の場合と同様のトリプシン消化および二次元電気泳動を行った。生体内とCKIIの両者における二次元電気泳動のパターンと比較したところ、両者に重複するリン酸化TRβ断片が認められた。以上の結果より、生体内におけるTRβのリン酸化にCKIIが関与していることが推定された。TRβ内には4個のCKII推定リン酸化部位が存在することから、現在各推定リン酸化部位の変異株TRβをsite-directed mutagenesisを用いて作成中である。今後は、それぞれの変異株での生体内リン酸化のパターンを比較することから、生体内CKIIリン酸化部位を明らかにする予定である。さらに、それらの変異株TRβを、甲状腺ホルモン反応DNA配列を有するレポータープラスミドとともにCV-1細胞にco-トランスフェクションした後にルシフェラーゼアッセイを行って野性型TRβの場合と比較することによって、CKIIによるリン酸化がTRβの転写活性に及ぼす役割に関しても、今後検討する予定である。