アシルコエンザイムA:コレステロールアシル基転移酵素に関する分子生物学的研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08044304
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 堀内 正公 熊本大学, 医学部, 教授 (10117377)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): CHANG TaーYua ダーツマス大学, 医学部, 教授 ; 袴田 秀樹 熊本大学, 医学部, 助手 (70284750)
• Keywords: コレステロール代謝 / ACAT / 泡沫細胞 / cDNAクローニング

Research Abstract

本共同研究によって以下の成果を得ている。
1、細胞レベルでの、コレステロールによるACAT活性調節機構の解析
コレステロール負荷、あるいは枯渇によってACATの活性が変化するか否かを、HepG2細胞を用いて検討した。細胞のコレステロールエステル化活性、ミクロゾームのACAT活性は負荷によって上昇し、逆に枯渇によって低下したが、mRNAレベルは変化しなかった(Biochim. Biophys. Acta 1301, 76-84, 1996)。これらの結果から、ACATにはコレステロールによる翻訳後調節機構の存在が示唆された。
2、ラットACATcDNAのクローニングと組織分布の解析
ラットACATcDNAのopen reading frameを、ラット副腎総RNAを鋳型にしたRACEによってクローニングした。動物細胞系の発現ベクター(pcDL-SRα)に組み入れ、一過性に293細胞へ、並びに定常的にCHO細胞へ過剰発現させたところ、それぞれ、3.1倍、2.9倍のACAT活性の上昇を確認した。本cDNAを用いたノーザンブロッティングでは、ラットACATmRNAは副腎>精巣>小腸>大動脈>肝臓の順に高発現していた。また、研究分担者のChang教授らの作成したポリクローナル抗ヒトACAT抗体(DM10)はラットACATにも交差反応したため、ウエスタンブロッティングによってACATタンパク質の組織分布を検討したところ、ラットACATの分子量はほとんどの臓器で45kDa程度(肝臓だけは50kDa)であり、副腎>肝臓>精巣>小腸>大動脈の順に強く発現していた。組織のACAT活性の強弱は、この結果に一致した。肝臓はタンパク質発現、活性に対してmRNA発現が低く、さらに分子量も異なるため、組織特異的な調節機構の存在が考えられた。また、ACATがオリゴマー形成する可能性があるため、臓器のミクロゾームを分子架橋剤と反応させ、DM10でウェスタンブロッティングしたところ、副腎並びに大動脈ACATはオリゴマー形成が見られたが、肝臓ACATのオリゴマーは観察されず、肝臓ACATは他の臓器とは分子構造が異なることが示唆された。これらの結果は現在投稿準備中である。
3、ACAT-associated proteinの可能性
上記の分子架橋剤を用いた検討で、副腎ACATには分子量10kDa程度のタンパク質がクロスリンクされることが示された。1の結果から、ACATには翻訳後修飾の可能性が強く示唆されており、この10kDa程度のassociate proteinは内因性の活性調節因子として働いている可能性がある。現在、このassociate proteinの単離・構造決定を試みている。
4、ラットACAT部分長に対する抗体作製
ACATの機能ドメインを明確にするために、ラットACATcDNAの欠失変異体をグルタチオンS-転移酵素(GST)との融合タンパク質として大腸菌に発現させ、解析する。また、これに対するポリクローナル抗体(家兎)、並びにモノクローナル抗体(マウス)を作製する。現在、GST融合タンパク質の発現・分離の系のセットアップが終了したところである。

Research Products

• [Publications] Hirofumi Matsuda et al.: "Activation of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase activity by cholesterol is not due to altered mRNA levels in HepG2 cells." Biochimica et Biophysica Acta. 1301. 76-80 (1996)
• [Publications] Yoshiko Suginohara et al.: "Human lipoprotein-deficient serum inhibits oxidized low density lipoprotein-induced accumulation of cholesteryl esters in macrophages." Atherosclerosis. 120. 167-179 (1996)
• [Publications] Masakazu Sakai et al.: "Reconstituted high density lipoprotein reduces the capacity of oxidatively modified low density lipoprotien for accumulation of cholesteryl esters in macrophages." Atherosclerosis. 119. 191-202 (1996)
• [Publications] Masakazu Sakai et al.: "The scavenger receptor serves as a route of intenalization of lysophosphatidylcholine in oxidized low density lipoprotein-induced macrophage proliferation." The Journal of Biological Chemistry. 271. 27346-27352 (1996)
• [Publications] Masakazu Sakai et al.: "Lysophosphatidylcholine potentiates the mitogenic activity of modified low density lipoproteins for human monocyte-derived macrophages." Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16. 600-605 (1996)
• [Publications] 袴田秀樹 他(分担)、: "「分子リピドロジー」II章.細胞内代謝の進歩 2.ACAT遺伝子の調節機構" 株式会社 メジカルセンス(in press), (1997)
• [Publications] 袴田秀樹 他(分担)、: "別冊・医学のあゆみ 高脂血症の分子生物学 19章.ACATとACAT阻害薬(96-100頁)" 医歯薬出版株式会社, 5 (1996)
• [Publications] 袴田秀樹 他(分担)、監修 山田信博、佐藤靖史: "細胞工学別冊・動脈硬化+高脂血症研究ストラテジー1-7.変性LDL(36-41頁) 2-3-3.泡沫化、脱泡沫化、抗泡沫化(159-164頁)" 株式会社 秀潤社, 12 (1996)
• [Publications] 袴田秀樹 他(分担)、監修 矢崎義雄、 編集 山田信博、小室一成、栗原裕基: "実験医学増刊・循環研究プロトコール 第1章 動脈硬化研究 4-1.マクロファージの培養法(初代培養/細胞株)(49-55頁)" 株式会社 羊土社, 7 (1996)