RuvC蛋白質によるホリデイ構造の認識に関する構造生物学的研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08280210
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 志田 敏夫 信州大学, 繊維学部, 講師 (40162599)
• Keywords: RuvC / ホリデイ構造 / 交叉点移動 / 合成DNA / 相同配列 / 安定同位体標識

Research Abstract

大腸菌のRuvC蛋白質は相同組換えの中間体であるホリデイ構造に特異的に結合して、そホリデイ構造(十字型DNA)を相同な二本の二本鎖DNAに切断する酵素である。本研究では合成DNAで構築した十字型DNA及び十字型DNAとRuvCの複合体の構造を生化学的手法及びNMRで解析し、微視的見知から相同組換えの過程を理解することを目的とした。
ホリデイ構造、特に交叉点部分の構造について:十字型DNAの交叉点部分だけを安定同位体^<13>Cでラベルして、交叉点部分のNMR情報を得ることを計画した。RuvCの基質になるmonomobileな十字型DNAの特定のチミン残基をラベルしたものを4種類測定した。測定の結果、複数のシグナルが現われ、100Hz以下の変換速度で複数の構造が平行状態にあることが分かった。
HJのスタッキング構造と切断部位との関係:ベンドしたDNA鎖と連続したDNA鎖で構成されるホリディ構造のどちらがRuvC素で切断されるか不明であった。オリゴTでスタッキング構造を固定したホリデイ構造を用いた実験の結果、切断部分は連続しているDNA鎖上にあることが分かった、
交叉点部分の水素結合の有無がRuvC活性に及ぼす影響:実験の結果、RuvCの認識には交叉点部分のAT塩基対のうちのA残基の方がRuvCに認識されている可能性があることが分かった。また、RuvCが結合したHJの交叉点部分には相補的水素結合がなくてもよいことが分かった。

Research Products

• [Publications] Toshio Shida: "Characterization and comparison of synthetic immobile and mobile Holliday junction" J.Biochem.119・4. 653-658 (1996)
• [Publications] Toshio Shida: "Analysis of substrate specificity of the RuvC Holliday junction resolvase with synthetic Holliday junctions" J.Biol.Chem.271・42. 26105-26109 (1996)