1996 Fiscal Year Annual Research Report
酵母小胞体の多重チトクロームP450の構造-機能相関と遺伝子発現制御の総合的解析
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08406009
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高木 正道 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (50018339)
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| Keywords | Candida maltosa / チトクロームP450 / n-アルカン / 基質特異性 / 遺伝子破壊 / 発現制御 / シスエレメント / 転写因子 |
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| Research Abstract |
1.酵母Candida maltosaが有する8種のP450(ALK1〜8)のうち,n-alkaneによって誘導される主要4つのP450の機能について,遺伝子破壊を行って検討した。1)これら4つの遺伝子全てを破壊した株はn-alkane資化能を失った。この結果,P450がn-alkane資化に必須であることが明らかとなると共に,n-alkaneで生育できない遺伝子破壊株の構築に成功した。この株は,来年度以降のin vivo組換え実験に利用できる。2)さらに,これら4つのうち,いずれか(一つあるいは複数)を破壊した株の生育特性,それらの株に対するプラスミドによる相補性,いずれかのみを大量発現させた株の特長,などについて検討した結果,n-alkaneに水酸基を添加する機能としてはお互いにoverlapしているが,4つのうち1つの基質特異性は明らかに他の3つとは異なることが明らかになった。
2.一方,β-galactosidaseをレポーター遺伝子としてそれぞれのP450遺伝子のプロモーター中のシスエレメントの同定を行った。1)ALK5のn-alkane誘導に関与するシスエレメントとして,約120bpの配列(ARR5)を同定した。2)ALK2のn-alkane,およびペルオキシソーム増殖剤による誘導に関与するシスエレメントとして,CGGを含むリピート配列の関与を明らかにした。
3.さらに,Candida maltosaのin vitro転写系を構築し,n-alkaneによる誘導に関与する細胞内因子の解析を行った。その結果,ARR5結合蛋白質は,常に細胞内(核内)に存在し,主要なものは26-kDaであること,DNAへの結合に亜鉛イオンが重要であること,基本転写因子と会合していることが明らかになった。
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[Publications] R.Ohtomo: "Peroxisome proliferations activate cytochrome P450 genes in an alkane-assimilating yeast,Candida maltosa." Biochem.Biophys.Res.Commun.222. 790-793 (1996)
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[Publications] T.Zimmer: "The CYP52 multigene family of Candida maltosa encodes functionally diverse n-alkane-inducible cytochromes P450." Biochem.Biophys.Res.Commun.224. 784-789 (1996)
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[Publications] S.-M.Park: "Galactose-inducible expression systems in Candida maltosa using promoters of newly-isolated GALI and GAL10 genes." Yeast. 13. 21-29 (1997)
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[Publications] T.Zimmer: "Protein quality-a determinant of the intracellular fate of membrane-bound cytochromes P450 in yeast." DNA and Cell Biology.
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[Publications] S.Mauersberger: "Nonconventional Yeast in Biotechnology" Springer-Verlag Berlin Heidelberg(Germany), 170 (1996)
