1996 Fiscal Year Annual Research Report
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08407021
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
橋本 公二 愛媛大学, 医学部, 教授 (00110784)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉井 克人 弘前大学, 医学部, 助手 (20236730)
藤山 幹子 愛媛大学, 医学部・附属病院, 助手 (60263935)
白方 裕司 愛媛大学, 医学部, 助手 (50226320)
中岡 啓喜 愛媛大学, 医学部・附属病院, 助手 (30172266)
宮内 俊次 愛媛大学, 医学部, 助教授 (10166118)
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| Keywords | アデノウィルスベクター / 表皮細胞 / ベータ・ガラクトシダーゼ / 遺伝子導入 / 無血清培養法 / 293細胞 / MOI |
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| Research Abstract |
本年度はアデノウィルスベクターによる表皮細胞への遺伝子導入の基礎的検討を行った。
遺伝子導入の方法としてアデノウィルスベクターを用い、外来性遺伝子はベータ・ガラクトシダ-セ遺伝子を使用し、遺伝子導入の判定はX-gal染色、ならびにベータ・ガラクトシダ-セ活性を測定することで判定した。ヒト表皮細胞は無血清培養法にて培養した。使用した細胞は3代から4代継代培養したもののみを用いた。アデノウィルスベクターはAdexlacZを用いた。AdexlacZを293細胞へ感染させ、大量に増幅させた後、超音波処理、塩化セシウム密度勾配法にて精製・濃縮しPBS(-)に対して透析したものを使用した。濃縮ウィルス液は力価測定の結果4x10^8PFU/mlであった。
感染効率、発現持続時間:100%の細胞でX-gal染色は陽性でありすべての細胞に外来性遺伝子の導入が可能であった。持続時間については7日後まではベータ・ガラクトシダ-セ遺伝子は発現していたが、染色性でみる限り細胞分裂により発現量は希釈されていた。
MOI(multiplicity of infection)の検討:MOIが高いほどX-gal染色は強く、beta-galactosidase activityも高かった。
infection timeの検討:5分間の感染でもX-gal染色は認められたが、感染時間の延長に伴って染色性の増加が認められた。さらに、定量的に検討すると120分までの感染時間では、感染時間に比例してbeta-galactosidase activityが増加した。
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