工業酵素の触媒反応の分子論的解析と蛋白質工学による機能増強に関する研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08456043
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 一島 英治 東北大学, 農学部, 教授 (60015063)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山形 洋平 東北大学, 農学部, 助手 (40230338) ; 吉田 孝 東北大学, 農学部, 助手 (80200997) ; 中島 佑 東北大学, 農学部, 助教授 (20091720)
• Keywords: アスペルジロペプシンI / ペプシン / セリンカルボキシペプチダーゼ / アルファー・マンノシダーゼ / チロシナーゼ / ズブチリシン

Research Abstract

ペプシン・ファミリーのアスパラギン酸プロテアーゼのうち,AspergillusやPenicilliumの酵素は酸性側でトリプシノーゲンの活性化能をもつ.この分子機構を明らかにするため,アスペルジロペプシンエのcDNAに部位特異的変異を与え,酵母,大腸菌で発現させた変異酵素の研究から,トリプシノーゲン活性化反応に必須の残基はD76であることを明らかにした.さらに,トリプシノーゲン活性化能をもたないブタペプシンのcDNAに部位特異的変異をる与え大腸菌で発現させた二重変異酵素T77D/G78〔S〕S79はトリプシノーゲン活性化能を獲得した.かくして,アスパラギン酸プロテアーゼの2触媒機能性の分子機構を世界に先駆けて解明した.
Aspergillusセリンカルボキシペプチダーゼは9ヶ所のN-グリコシル糖鎖結合部位を持つ.糖鎖欠損のN212QとN371Q変異酵素はそれぞれ活性が激減し,N347Q糖鎖欠失酵素は細胞外で部分分解を受けた.活性中心(S153, D357, H436)に近い上記3残基の糖鎖は活性に大きな影響をもつことを明らかにした.
Aspergilus 1,2-α-マンノシダーゼcDNAに部位特異的変異を支え酵母で発現させた変異酵素の活性に大きな影響を与えたカルボキシル基5残基を明らかにした.
Aspergillusプロチロシナーゼ遺伝子(melO)のcDNAに部位特異的変異を与え酵母による発現で得た変異酵素の活性は、ヘモシアニンに相当するCu(A)に配位する3残基のヒスチジンの外1残基のシステインが活性に関わることと,同じくCu(B)に配位する3残基のヒスチジンの外に1残基のヒスチジンが関わることを明らかにした.
活面活性剤耐性のズブチリシンALPIの遺伝子aprQにpH12のアルカリ性耐性のズブチリシンSendai遺伝子AprSのC末端領域を交換しBacillusで発現してキメラ酵素は,海面活性剤耐性とpH12のアルカリ性耐性の両性質を共に備えた機能増強酵素であることを明らかにした.

Research Products

• [Publications] K. Matsumoto: "Molecular cloning and nucleotide sequence of the complementary DNA for penicillolysin gene, plnC, an 18kDa metalloendopeptidase gene from Penicillium citrinum" Biochim. Biophys. Acta. 1218. 469-472 (1994)
• [Publications] Y. Chiba: "Cloning and expression of the carboxypeptidase gene from Aspergillus saitoi and determination of the catalytic residues by site-directed mutagenesis." Biochim. J.308. 405-406 (1995)
• [Publications] T. Inoue: "Molecular cloning and nucleotide seuence of the 1,2-α-mannosidase gene, msdS, from Aspergillus saitoi and expression of the gene in yeast cells." Biochim. Biophys. Acta. 1253. 141-145 (1995)
• [Publications] Y. Fujita: "Molecular cloning and nacleotide sequence of the protyrosinase gene, melQ, from Aspergillus oryzae and expression of the gene in yeast cells." Biochim. Biophys. Acta. 1261. 151-154 (1995)
• [Publications] T. Yoshida: "Molecular cloning and nucleotide sequence of the genomic DNA for 1,2-α-D-mannosidase gene, msdC, from Penicillium citrinum." Biochim. Biophys. Acta. 1263. 159-162 (1995)
• [Publications] T. Shintani: "Characterization of the S_1 sulsite specificity of aspergillopepsin I by site-directed mutagenenesis." J. Biochem.120. 974-981 (1996)
• [Publications] 一島英治: "酵素は生きている-産業酵素へのいざない-" 裳華房, 157 (1995)
• [Publications] 一島英治: "酵素の化学,第2刷" 朝倉書店, 201 (1996)