1996 Fiscal Year Annual Research Report
糸状菌における糖質関連酵素遺伝子群の発現制御に関する分子生物学的解析とその応用
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08456049
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
塚越 規弘 名古屋大学, 農学部, 教授 (50115599)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 雅士 名古屋大学, 農学部, 助手 (70242849)
小林 哲夫 名古屋大学, 農学部, 助教授 (20170334)
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| Keywords | Aspergillus / タカアミラーゼA / キシラナーゼ / セルラーゼ / 転写因子 / AnCP / CCAAT / HAP複合体 |
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| Research Abstract |
タカアミラーゼA遺伝子の転写促進因子AnCPは、大量培養した菌体から核画分を調製後、核タンパク質を抽出し、ヘパリンカラム等を使用して部分精製した。このサンプルを用いて、さらに高度に精製を試みた結果、約30kDaのタンパク質がCCAAT結合活性を有していることを明らかにすることができた。一方、オーストラリアのHynes等によりクローン化されたhapC cDNAを使用して、MalEとの融合タンパク質として大腸菌内で発現させ、HapCタンパク質を大量に調製した。このタンパク質に対するウサギ抗体を作製し、ウエスタンブロッティング解析を行った結果、上記約30kDaのタンパク質には複数のタンパク質が含まれ、複合体を形成してDNAに結合したと推測した。また、様々な解析からA.nidulansにも酵母と同様なHap複合体が存在することが示唆された。一方、A.nidulansHapC変異体には全くCCAAT結合活性を検出できなかったばかりか、この核タンパク質にHapCのMalE融合タンパク質を混合しても、結合活性を再構築できなかった。今後、これらの現象をさらに解析する予定である。
C.gracile由来のキシラナーゼ遺伝子はA.nidulans内で構成的に発現するが、5'非翻訳領域を順次欠損させると、その発現量が100倍にも増加した。現在、その理由について分子レベルで解析を行っているが、本質的には本遺伝子は構成的に発現しているため、今後はA.oryzaeに由来するキシラナーゼ遺伝子を解析する予定である。一方、A.nidulansセルラーゼについては酵素精製を試み、3種類のセルラーゼが存在することを明らかにし、そのうち最大に発現している35kDaの酵素の部分アミノ酸配列を決定し、本酵素遺伝子の部分的なクローン化に成功している。
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[Publications] Masashi Kato: "An Aspergillus nidulans nuclear protein,AnCP,involved in entranciment of Taka-amylase A gene expression,bints to the CCAAT-containing TAAG^2,amdk and gal A promoters." Mol.Gen.Genet.(in press). (1997)
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[Publications] Noriyuki Kitamoto: "Molecular cloning purification and characterization of two ondo-1,4-glucanases from Aspergillus onyzae KBN 616" Appl.Microbiol.Biotechnol.46. 538-544 (1996)
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[Publications] Masashi Kato: "Seguence specific binding sites in the Taka-amylase A G2 promoter for the Cre A represson mediating carbon catabolite nepression" Biosci.Biotechnol.Biochem.60. 1776-1779 (1996)
