メチロトローフ酵母の細胞機能を利用した生体触媒系の構築と分子基盤

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08456051
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 加藤 暢夫 京都大学, 農学部, 教授 (50026556)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 由里本 博也 京都大学, 農学部, 助手 (00283648) ; 阪井 康能 京都大学, 農学部, 助教授 (60202082)
• Keywords: メチロトローフ酵母 / Candida boidinii / D-アミノ酸オキシダーゼ / ペルオキシソーム / カタラーゼ / 異種遺伝子発現系 / アルコールオキシダーゼ / 過酸化水素

Research Abstract

ペルオキシソーム酵素遺伝子の応用と酵素発現用宿主の創製に関する研究を行った。
a)D-アミノ酸オキシターゼ(DAO)と抗生物質生産プロセスへの利用
Candida boidiniiよりDAO遺伝子をクローニングし、そのC-末端はペルオキシソームへの移行イグナルである-AKLであり、DAOがペルオキシソーム酵素であることがわかった。さらにDAO遺伝子破壊株を取得し、DAOの生理的意義の詳細な検討を行っている。またアルコールオキシダーゼ(AOD)のプロモーターを用いたDAO大量発現株よりDAOを精製し、諸性質を明らかにした。
b)オキシダーゼ発現宿主の創製
オキシダーゼを大量に発現させる新たな宿主として、C.boidinii AOD遺伝子破壊株を作成した。糖尿病診断用酵素として有用な糖化アミノ酸オキシダーゼ(FAOD)AOD遺伝子破壊株で発現させ、AOD遺伝子を破壊していない株で発現させたときより、大量に発現していることができた。
c)カタラーゼと高濃度過酸化水素分解反応
C.boidiniiよりカタラーゼ遺伝子をクローニングし、AODプロモーターを用いて大量発現させた。ペルオキシソームで発現された株(CAO株)とペルオキシソーム移行シグナルを除去し、細胞質中で発現させた株(CANS株)を作成したところ、野性株と比較してそれぞれ約2倍、約3.5倍のカタラーゼ活性を示した。また両株におけるカタラーゼの細胞内局在性を調べたところ、CAO株ではペルオキシソームに、CANS株では細胞質に局在していた。また両株の菌体反応による過酸化水素の分解について検討したところ、菌体をfeedすることにより、高濃度の過酸化水素を効率よく分解できた。

Research Products

• [Publications] N.Yoshida et al.: "Primary structures of fungal fructosylamino acid oxidases and its application to the measurement of glycated proteins." Eur.J.Biochem.242. 499-503 (1996)
• [Publications] Y.Sakai et al.: "The absence of Pmp47, a putative yeast perixisomal transporter, causes a defect in transport and folding of a specific matrix enzyme." J.Cell Biol.34. 37-51 (1996)
• [Publications] Y.Sakai et al.: "High-level sectetion of fungal glucoamylase using the Candida boidinii gene expression system." Biochim.Biophys.Acta,. 1308. 81-87 (1996)
• [Publications] Y.Sakai et al.: "Production of fructosyl lysine oxidase from Fusarium oxysporum S-1F4-on autoclave-browned Medium." Biosci.Biotech.Biochem.60. 150-151 (1996)