1996 Fiscal Year Annual Research Report
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08457055
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
錦見 盛光 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20022816)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松井 仁淑 和歌山県立医科大学, 医学部, 助手 (50209475)
白石 則之 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (30133169)
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| Keywords | 銅結合性タンパク質 / S100bタンパク質 / キレート / 活性酸素障害 / 抗酸化作用 / アスコルビン酸 |
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| Research Abstract |
活性酸素による組織障害における遊離金属イオンの関与の重要性が指摘されている。本研究においては、細胞内で遊離銅イオンを結合するタンパク質が、活性酸素障害の防御に寄与する可能性を追究するため、ウシ脳から銅結合性タンパク質の精製を試みた。まず、タンパク質の銅イオン結合脳をアスコルビン酸の銅イオンによる酸化の促進効果を抑制する力価として測定する簡便な方法を確立した。この方法を用いてウシ脳のアセトンパウダー抽出液中の銅結合性タンパク質をDEAEセルロースとセファデックスG-75を用いるクロマトグラフィーで分離精製を行った。その結果、分子量約20,000のものが高度に純化されたので、これをさらに逆相HPLCによって精製し一次構造の決定を行った。リシルエンドペプチターゼで消化して得られるペプチドのうち2個のもののアミノ酸配列をタンパク質のアミノ酸配列のデータベースで検索したところ、いずれのペプチドも配列がウシ脳のS-100βと完全に一致した。さらに、ウシ脳のS-100bタンパク質(S-100βサブユニットの二量体)の精製標品を上記のアスコルビン酸酸化反応を用いて銅イオン結合脳を定量的に調べ、S-100bタンパク質一分子当り5個の銅イオンが結合することを見出した。これらの結果から従来カルシウム結合タンパク質として研究されてきた本タンパク質が銅イオンを結合する能力をつこが明らかとなった。さらに、組換えS100bタンパク質を得る目的で、ラットのS-100βサブユニットのcDNAをラット小脳のmRNAからRT-PCR法で作製し、pGEX-5X-3(グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質を作るためのベクター)に挿入して大腸菌で高度に発現させることのできる系を確立した。
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