in vitro transformutionによる骨肉腫発生機序の解明

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08457388
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 戸口田 淳也 京都大学, 生体医療工学研究センター, 助教授 (40273502)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐々木 正夫 京都大学, 放射線生物研究センター, 教授 (20013857) ; 中村 孝志 京都大学, 医学研究科, 教授 (10201675)
• Keywords: 骨肉腫 / 形質転換 / p53遺伝子 / Rb遺伝子 / 骨芽細胞

Research Abstract

1.p53欠損マウス由来骨芽細胞様細胞株の樹立
p53欠損マウス(p53-l-)新生仔牛頭蓋骨より、常法に従い骨芽細胞を分離し、比較的早期の段階てクローニングを試み、ALPを指標として分化形質を携えた細胞を選択した。その結果得られた細胞系MMC2F、ALP、オステオカルシン、I型コラーゲン等を発現しており、更にin vitroにおいて石灰化を認めるなど、分化能をもつ骨芽細胞の形質を有していた。さらにBMP及びBMP受容体も発現しており、ヌードマウス皮下に接種すると、異所性骨化巣を形成すという、これまで樹立された骨芽細胞様細胞系では認められなかった特質を持つことが判明した。MMC2は不死化細胞株であるが、造腫瘍性など癌細胞としての形質は認められなかった。
2.E7蛋白導入による形質転換
この細胞においてRB蛋白を機能的に不活化するために、ヒトパピローマウィルスのE7抗原をレトロウィルスベクターを用いて導入した。導入された細胞では細胞密度の増加、血清要求性の低下等の変化が認められたが、寒天培地でコロニーを形成せず、またヌードマウスでの造増殖性も殆ど認められず、E7導入では、完全な癌形質は獲得出来ない可能性が示唆された。
3.腫瘍形成クローンの解析
一方、低頻度ではあるがヌードマウスでの腫瘍形成が認められた。同一ディッシュよりの細胞の再接種で、やはり低頻度で腫瘍形成が認められたことにより、in vivoでの突然変異により増腫瘍性が獲得されたのではなく、特定のクローンがin vivoで選択されたと考えられる。in vivoの腫瘍より樹立した細胞は、100%腫瘍を形成する完全に癌化した細胞であった。現在この癌細胞と、MMC2及び腫瘍を形成しないE7導入細胞との間で、どのような遺伝子の発現が変化しているのかをdifferential display法により解析中である。

Research Products

• [Publications] T.Yamaguchi,et al.: "Loss of heterozygosity and suppressor gene mutations in chondrosarcomas." Anticancer Res. 16. 2009-2016 (1996)
• [Publications] M.V.Kato,et al.: "Loss of heterozygosity on chromosome 17 and mutations of the p53 gene in retinoblastoma." Cancer Letters. 106. 75-82 (1996)
• [Publications] T.Nakayama,et al.: "Fracture healing is a process independent of p53 function." in vivo. 10. 553-558 (1996)