P.gingivalisの歯周病原性に関する分子生物学的解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08457485
• Research Institution: Kanagawa Dental College
• Principal Investigator: 梅本 俊夫 神奈川歯科大学, 歯学部, 教授 (20067036)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 祐介 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (20267511) ; 浜田 信城 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (20247315)
• Keywords: Porphyromonas gingivalis / fimA / 線毛

Research Abstract

本研究の目的は歯周病原細菌であるP.gingivalisの病原因子と考えられている線毛、血球凝集素、システインプロテアーゼおよび主要外膜タンパク質の遺伝子を単一あるいは複数不活化した変異株を作製することにより、それらの病原因子の性状を明らかにするとともに、各遺伝子と歯周病原性の関わりを明らかにすることである。
本年度は、細胞への付着に関与する線毛の遺伝子fimAを不活化し、43kDaの線毛タンパク質を欠く変異株を作製した。変異株の作製は、まずクローン化された線毛遺伝子内にエリスロマイシン耐性遺伝子を挿入して、線毛遺伝子を不活化したエリスロマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片をsuicide vector pGP704に挿入したプラスミドを作製した。この線毛遺伝子を不活化した断片を含むプラスミドを導入した大腸菌株とP.g ATCC33277株および381株を用いて共培養し、P.g ATCC33277株および381株に接合伝達させ、相同的組換えによる変異株の作製を行った。
その結果、サザンハイブリダイゼーションによりP.g染色体DNA中に線毛遺伝子とエリスロマイシン耐性遺伝子のいずれにもハイブリダイズする断片の存在を確認されたことから線毛遺伝子を不活化した断片が染色体上に組み込まれたことが確認された。線毛欠失株の確認は、線毛に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより線毛蛋白質の有無を検討するとともに、電子顕微鏡観察により行った。すなわち、菌体を2% uranyl acetateで染色し、菌体表層の線毛の有無を観察し、さらに線毛に対する抗体を用いてイムノゴールド法により線毛の存在を確認した。