新しい酸化ストレス誘導性タンパクを用いた再建術後生着予測マーカーの開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08457540
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 吉田 廣 筑波大学, 臨床医学系, 教授 (80014330)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石井 哲郎 筑波大学, 基礎医学系, 助教授 (20111370)
• Keywords: A170 / MSP23 / 酸化ストレス / ストレスタンパク質 / 過酸化水素 / パラコート

Research Abstract

1.従来まで部分欠落のあったA170タンパクのcDNAに対し、5'RACE法をもちいて全長を決定した。
2.クローン化されたマウスcDNAの組み換え体によりA170タンパク質の全長と部分構造を持つ組換え体融合タンパク質を2系列、計5種類を作製し、基礎的検討の材料とした。また、それらを用いて抗A170タンパク質抗体を作製した。
3.上で製作した抗A170タンパク質抗体を用いて、本タンパク質が微少の酸化ストレスで特異的に誘導されることウエスタンブロッティング法により確認し、さらに、経時変化、誘導量をスーパーオキサイド産生試薬であるパラコートやメナジオンで刺激し、その応答量をタンパクレベルだけでなく、mRNAレベルでも誘導されることを示した。
4.さらに、上記抗体をもちいて、細胞内A170の局在を蛍光レーザー顕微鏡で確認した。
5.A170をリン酸化するキナーゼをゲル内リン酸化法を用いて見出し、外界からの活性酸素ストレスの伝達系の経路に関する示唆をえた。また、そのキナーゼの刺激に対する応答性を調べた。
6.極微少濃度の過酸化水素が同タンパク質を誘導することを見出し、さらに転写誘導のほかにタンパク分解の調節によって量的な変化を制御していることを示唆する結果を得た。
7.MSP23については、ラットホモローグのクローニングに成功した。
8.MSP23抗体をもちいて組織染色をおこなったところ、中枢神経系ではオリゴデンドロサイトとアストロサイトに局在することがわかった。
以上により酸化ストレス誘導タンパクの検出のための材料の作製、および、酸化ストレスに対する基礎的なデータを得た。次年度以降、生体の応答の基礎的データをさらに得るとともに、より臨床への適用を考えた検討をおこなう予定である。

Research Products

• [Publications] Tetsuro Ishii: "Murine perioneal macrophages Induce a novel 60-kD aprotein with structural similarity to a tyrosine kin ase p56lck associated protein in response to chroniclowlevel oxidative stress." Biochem.Biophys.Res.Commun.226. 456-460 (1996)
• [Publications] Tetsuro Ishii: "Low micromolar levels of hydrogen peroxide and proteasome inhibitors induce the 60-kDaA170stress protein in murine pertionealmacrophages." Biochem.Biophys.Res.Commun.(in press). (1997)
• [Publications] 石井 哲郎: "新しい抗酸化酵素ペルオキシレドキシンファミリー" 医学のあゆみ. 178. 406-407 (1996)
• [Publications] 石井 哲郎: "ぺルオキシレドキシン:新しい抗酸化タンパク質ファミリー" 細胞工学. 15. 1416-1421 (1996)
• [Publications] 石井 哲郎: "ベルオキシレドキシンMSP23の構造と抗酸化機能" 腎とフリーラジカル. (印刷中). (1997)