1997 Fiscal Year Annual Research Report
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08457604
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
山口 明人 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (60114336)
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Keywords | 異物排出蛋白 / テトラサイクリン耐性 / 多剤排出蛋白 / Cys走査変異 / トポロジー / 部位特異変異導入 / NEM / 部位特異化学修飾 |
Research Abstract |
本研究では、主としてテトラサイクリン排出蛋白Tet(B)を素材として、異物を排出する膜輸送系の立体構造の推定と、基質輸送経路の解明を行った。まず、Cys-free変異体をもとに、任意の位置の残基をCysに置換した変異体を多数構築し、膜透過性のSH試薬NEMと、膜不透過性のAMSを用いて、生菌体で両者ともに結合するものは菌体表層(ペリプラズム側)、NEMのみ結合するものは菌体の内側という基準で、膜を12回貫通する蛋白であることを、初めて活性のある膜蛋白を用いて実験的に決定することに成功した。この方法は異物排出蛋白のみならず、膜貫通蛋白の構造決定に広く応用できる普遍的な方法である。ついで、連続的にCys置換した一連のCys走査変異体を用いて、疎水的な領域ではNEMとの反応性が悪く、親水的な領域では良いという原理に基づいて、膜貫通領域の範囲を精密に決定した。このことから、さらに、ある特定の膜貫通セグメントには膜内部であってもNEMの結合する部分が存在すること、すなわち、基質が透過する親水性のチャネルが存在することを見いだした。NEMとの反応性を測定することにより、変異導入や、基質との相互作用によるコンホメーション変化を測定できることも明らかになった。これにより、(1)基質によって、inside closed/outside open構造から、inside open/outside closed構造への構造変化が起こることがわかり、入り口と出口が同定できた。(2)細胞質側の変異が、ペリプラズム側の変異によって抑圧される現象は多くの研究者が発見しているが、その原因は不明であったが、この方法により、第一変異によって起こる遠隔構造変化が、抑圧変異によって阻止されるという機構が解明された。さらに、本研究に基づき、膜輸送蛋白としては初めて、立体構造モデルを提出することに成功した。
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Research Products
(6 results)
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[Publications] Kimura,T.et al.: "Remote Conformational Effects of the Gly62 → Leu Mutation of the Tn10-Encoded Metal-Tetarcycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli and Its Second-Site Suppressor Mutation." Biochemistry. 36. 6941-6946 (1997)
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[Publications] Hirata,T.et al.: "A Novel Compound,1,1-Dimethyl-5- (1-hydroxypropyl) -4,6,7-trimethylindan,is an Effective Inhibitor of the tet (K) Gene-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Staphylococcus aureus." FEBS Lett.412. 337-340 (1997)
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[Publications] Fujihira,E.et al.: "Roles of Acidic Residues in the Hydrophilic Loop Regions of Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Staphylococcus aureus." FEBS Lett.419. 211-214 (1997)
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[Publications] Someya,Y.et al.: "Second-Site Suppressor Mutations for Arg70 Substitution Mutants of the Tn10-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli." Biochim.Biophys.Acta. 1322. 230-236 (1997)
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[Publications] Kimura,T.et al.: "Cysteine-Scanning Mutagenesis around Transmembrane Segment III of Tn10-Encoded Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter." J.Biol.Chem.273. 1-5 (1998)
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[Publications] Kimura,T.et al.: "Roles of Conserved Arginine Residues in the Metal-Tetracycline/H^+ Antiporter of Escherichia coli." Biochemistry. 37(in press). (1998)