カブトガニ血球細胞内大・小顆粒に含まれる生体防御物質群の構造解明と作用機作の研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08458183
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 牟田 達史 九州大学, 理学部, 助手 (60222337)
• Keywords: リポ多糖 / レクチン / 生体防御 / リピドA

Research Abstract

今回、新規にカブトガニ血球細胞内に見い出したレクチンは、Ca^<2+>依存的にヒトA型赤血球を凝集することでTachylectin-2とは大きく異なっている(Tachylectin-4と命名)。Tachylectin-4は、Dextran Sulfate-セファロースCL-6B、セファロースCL-6B、Fuc-アガロースを用いて精製され、50gの血球から約0.5mg得られた。Tachylectin-4のヒトA型赤血球凝集活性はキレート剤や高濃度のFucやN-Acetylneuraminic acidで阻害されるが、LPSで強く阻害された。LPSによる阻害は、O抗原多糖をもつLPSによってのみ観察され、リピドAとKDOのみからなる変異体のLPSによってはまったく阻害が見られない。従って、Tachylectin-4は、LPSのO-chainあるいはOuter coreに存在する糖鎖を認識している可能性が高い。Superdexによるゲル濾過では、Tachylectin-4は、分子量470,000の位置に溶出されたが、SDS-PAGEでは分子量30,000と31,000の2種のサブユニットから成り、多量体を形成していると思われる。逆相HPLCで分離した両サブユニットを、リジルエンドペプチダーゼによるペプチドマップで比較したところ、両者は非常によく似たisoproteinであることが示唆された。そこで、Tachylectin-4をGlycosidase Fで処理した後SDS-PAGEしたところ、分子量30,000のバンドのみが観察されたことから両サブユニットの差は、N-結合型糖鎖の差であることが予想される。次に、Tachylectin-4の部分アミノ酸配列の情報をもとにのcDNAクローニングを行い、全塩基配列を決定した。Tachylectin-4の前駆体は23アミノ酸残基のシグナル配列と232アミノ酸残基の成熟蛋白質からなり、一箇所のN-結合型糖鎖の付加部位が存在することが判明した。この配列をもとにホモロジーを検索したところ、Xenopus laevisの機能不明の蛋白質であるXL-PXN1のアミノ末端側領域と25%の配列相同性を持つことが判明した。

Research Products

• [Publications] Kawabata,Shun-ichiro: "Limulus kexin" FEBS Letter. 386. 201-204 (1996)
• [Publications] Lal Agarwala,Kishan: "Limulus intracellular coagulation inhibitor type 3" Journal of Biological Chemistry. 271. 23768-23774 (1996)
• [Publications] Kawabata,Shun-ichiro: "Tachycitin,a Small Granular Component in Horseshoe Crab Hemocytes,is an Antimicrobial Protein with Chitin-binding Activity" Journal of Biochemistry. 120. 1253-1260 (1996)
• [Publications] Kawabata,Shun-ichiro: "Limulus factor D,a 43-kDa protein isolated from horseshoe carb hemocytes,is a serine protease homologue with antimicrobial activity" FEBS Letter. 398. 146-150 (1996)
• [Publications] Iwaki,Daisuke: "Molecular cloning of limulus α2-macroglobulin" European.Journal of Biochemistry. 242. 822-831 (1996)
• [Publications] Lal Agarwala,Kishan: "A cysteine protease inhibitor stored in the large granules of horseshoe crab hemocytes" Journal of Biochemistry 119. 119. 85-94 (1996)
• [Publications] Kawabata,Shun-ichiro: "New Directions in invertebrate immunology" Clotting cascade and defense molecules found in hemolymph of horseshoe crab, 494 (1996)