1997 Fiscal Year Annual Research Report
Na/K-ATPase : Na-イオンによる酵素活性調節の分子機構
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08458194
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| Research Institution | KYOTO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
竹安 邦夫 京都大学, 総合人間学部, 教授 (40135695)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 雅彦 京都大学, 総合人間学部, 助手 (20283575)
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| Keywords | イオンセンサー / サブユニット会合 / Na / K-ATPase / Ca-ATPase / イオン輸送 |
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| Research Abstract |
研究代表者は、これまでにNa/K-ATPaseのサブユニット会合ドメイン、阻害剤結合ドメイン、KやNaに感受性のあるドメイン(イオンセンサー)を同定した。本研究(平成8-9年の2年間)は、「イオンセンサー領域はATPase分子内の"あるドメイン"にイオン特異的に直接作用を及ぼし酵素活性を調節する」という分子論的作業仮説に対する直接的証拠を得ることを目的とする。本年度は以下のような結果を得た。(1)N-末端(Met^1-Leu^<69>)に存在するNa-感受性部位(Na-センサー)によるATPase活性調節の分子機序を解明するため、単離・精製したNa-センサーペプチドを^<32>Pでラベルし、これと結合する領域を探索したところ、M4とM5間の細胞内親水性領域が候補者として検出された。即ち、Na-センサーはATPase分子内のドメインに特異的に直接作用を及ぼし酵素活性を調節することが判った。そこで、酵母のTwo Hybrid系を用いて相互作用する領域をさらに詳細に検索したところ、Na^+センサーはFSBA-結合部位(Lys^<724>-Lys^<725>)を含んだSer^<692>-Thr^<779>領域に結合した。(2)一方、Na^+、K^+-ATPaseのカルボキシ末端に細胞膜Ca^<2+>-ATPaseのカルモジュリン結合部位(CBD)を付加したキメラ(α-CBD)は、βサブユニットの存在如何に関わらず細胞表面に発現し、[^3H]ウワバインを結合する。しかし、このα-CBDキメラがNa^+とK^+を輸送するためにはβサブユニットの存在が不可欠である。このキメラのイオン特異性を更に検討したところ、野生型の3Na^+/2K^+交換輸送能に対して、2Na^+/2K^+であってelectrogenicではなかった。(3)また、Na^+/K^+-ATPaseの膜貫通領域M1-M10を含んだ疎水性領域とCa^<2+>-ATPaseのATP結合部位を含んだ親水性領域とから構成されたキメラ(NCN)はNa^+/K^+-ATPase活性を示し、^<86>Rbを内向きに輸送する。細胞内Na^+濃度を高めることによりポンプ電流も検出されることから、イオン輸送機能とその特異性は、M1-M4を含んだN-末端領域とM5-M10を含んだC-末端領域によって決定されると考えられる。その他のキメラATPaseの研究から、特に、M3M4とM5M6領域はATPaseのイオン特異性を決定しており、N-末端の細胞質領域およびM9-COOH領域はイオンによる調節部位を含んでいると考えられる。
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[Publications] S.H.Yoshimura: "Ion-sensitive Domains of the SERCA-and the Na^+/K^+-ATPase Identified by Chimeric Recombination." Annal.New York Acad.Sci.,. 834. 588-591 (1997)
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[Publications] J.Zhao: "Transport Activity of a Chimeric Na^+,K^+-ATPase with Ca^<2+>/Calmodulin Binding Domain from Ca^<2+>-ATPase in Xenopus oocytes." Annal.New York Acad.Sci.,. 834. 372-375 (1997)
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[Publications] K.Takeyasu: "Atomic Force Microscopy of E.coli F0F1-ATPase in Reconstituted Membranes." Annal.New York Acad.Sci.,. 834. 149-152 (1997)
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[Publications] S.Wang: "P-type ATPase in Tetrahymena." Annal.New York Acad.Sci.,. 834. 158-160 (1997)
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[Publications] K.Takeyasu: "Atomic Force Microscopy of Na^+/K^+-ATPase."Procedures in Scanning Probe Microscopy"(Eds.Colton,Engel,Frommer,Gaub,Gewirth,Guckenberger,Heckl,Parkinson & Rabe)" John Wiley & Sons,Ltd..(In Press), (1998)
