1996 Fiscal Year Annual Research Report
基本転写印紙TFIIEとTFIIHによる転写の多段階制御と細胞周期への関与の研究
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08458198
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大熊 芳明 大阪大学, 細胞生体工学センター, 助教授 (70192515)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前川 隆文 大阪大学, 細胞生体工学センター, 助手 (90273721)
益谷 央豪 大阪大学, 細胞生体工学センター, 助手 (40241252)
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| Keywords | 基本転写因子 / 転写 / TFIIE / TFIIH / 細胞周期 / CAK / キナーゼ |
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| Research Abstract |
1.無細胞転写再構成系の構築
まず転写再構成系を構築した。PolII、TFIID、TFIIHは、ヒトHeLa細胞から精製し用いるため、この細胞の大量培養システムを確立した。細胞核抽出液は、米国Roeder研のものと同程度の転写活性を示した。一方、基本転写因子TFIIB、IIE、IIF及びTFIIDのTATA結合因子TBPは、大腸菌で発現後、精製した。
2.TFIIEβの機能-活性解析
TFIIEは、TFIIHの活性制御以外に転写が開始される際に機能すると考えられる。この可能性の検討のため、TFIIEの34kDaサブユニットTFIIEβの解析をN末、C末から削った変異体及び内部欠失変異体を作成し、検討した。その結果、N末の50アミノ酸を削っても転写活性は影響を受けず、C末から13個削るとまだ活性は見られるが野生株の10%以下となった。次にTFIIEβがどの基本転写因子と結合するかを調べたところ、TFIIBとTFIIFβと強く結合することが明らかとなったので、TFIIEβ内のこれらの因子の結合領域を解析した。その結果、両者は共にC末端近傍の塩基性領域(アミノ酸257番-277番目)に結合した。TFIIEβは、プロモーター上の転写開始点上流-14から-2という二本鎖DNAの開裂がまさに起こる領域へ結合することが示されているが、上記結果を総合すると-14付近でC末端を上流側に向けてTFIIB、TFIIFβと結合すると考えられる。
3.TFIIHのCAK成分解析
細胞周期で特にG1期からS期への移行の際にTFIIHの成分CAKキナーゼは、Cdk7、サイクリンH、MAT1のサブユニットよりなり、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)をそのインヒビター(CDKインヒビター)群と共に制御すると考えられる。そこでこれらの蛋白質の発現と転写活性の細胞周期に伴う動向を調べるため、まずこれらを大腸菌内で産生させ、精製して、抗体を調製した。今後、これらを用いた転写と細胞周期の制御との関連の解析を進める。
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[Publications] Kawakami,K.et al.: "Characterization of the cove promoter of the Na^+/K^+-ATPase α 1 subunit gene." Euv.J.Biochem.237. 440-446 (1996)
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[Publications] Kojima,S.et al.: "Transcriptional activation domain of human BTEB2,a GC box-binding factor." J.Biochem.121. 389-396 (1997)
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[Publications] Ito,K.et al.: "C-Jun stimulates origin-dependent DNA unwinding by polymavirus large Tantigen." EMBO J.15. 5636-5646 (1996)
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[Publications] Sugasawa,K.et al.: "HHR23B,a human rad 23 homolog,stimulates XPC protein in nucleotide excision repair in vitro" Mol.Cell.Biol.16. 4852-4861 (1996)
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[Publications] Maekawa,T.et al.: "A cell-free system of Tn3 transposition and transposition immunity" Genes to Cells. 1. 1007-1016 (1996)
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[Publications] Maekawa,T.et al.: "Specific nicking at the 3′ends of the terminal inverted repeat sequences in transposon Tn3 by transposase and an E.coli protein ACP." Genes to Cells. 1. 1017-1030 (1996)
