新規ヒスタミン生成菌及び缶詰変敗菌の迅速検出・同定システムの開発

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08556034
• Research Institution: Tokyo University of Fisheries
• Principal Investigator: 藤井 建夫 東京水産大学, 水産学部, 教授 (30093305)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山崎 浩司 北海道大学, 水産学部, 助教授 (40250500) ; 猪上 徳雄 北海道大学, 水産学部, 教授 (60002086) ; 横本 敬紀 パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ, 事業部, 研究員 ; 木村 凡 東京水産大学, 水産学部, 助教授 (50262340)
• Keywords: ヒスタミン / 迅速検出 / 遺伝子手法 / TaqMan法 / Alicyclobacillus acidoterrestris / Clostridium perfiringens

Research Abstract

新規ヒスタミン生成菌および缶詰変敗菌の迅速検出・同定システムの開発を目的として以下の研究を行った。
藤井・木村(東京水産大学)・横本(パーキンエルマジャパン)
本年度は、平成8,9年度研究で決定したP.histaminumおよびデータベース上に登録されているヒスタミン生成菌、M.morganii,E.aerogenes,K.planticolaのヒスチジン脱炭素酵素の遺伝子配列から、相同性が高くプライマーに適していると思われる位置を決定し、PCR法によりヒスタミン生成菌が検出できるかの条件検討を行った。目的の長さの増幅断片がhdcを有するグラム陰性菌にのみ見られ、増幅断片をクローニング後配列の一部を決定したところ、増幅産物はhdcの目的領域であることを確認できた。魚体等より分離されたヒスタミン生成能を持つグラム陰性株15株のうち、14株にバンドが検出された。ヒスタミン生成能を持たない株132株ではバンドは検出されなかった。また、横本らと共同で、蛍光プロープPCR法(TaqMan法)の食品からの細菌の迅速検出・同定応用への実効性について、サルモネラをモデルに培養法と比較することで証明した。
猪上・山崎(北海道大学)
本年度はまず平成8年度および9年度に確立したAlicyclobacillus acidoterrestrisおよびClostidium perfiringensの迅速検出法に最適な食品試料からの核酸調製法を検討し,A.acidoterrestrisでは15時間の前培養後にRNeasy Total RNAキットを使用した核酸抽出法,またCl.perfiringensでは前培養後にLysis-Phenol-Chloroform法が最も適当であることを見出した。最後に、今回開発した迅速検出法を実際の食品へ応用し,A.acidoterrestrisでは混入菌体量2cells/ml以上ならびCl.perfiringensでは1cell/ml以上で検出可能であることを確認し,その実用性の高さを証明した。

Research Products

• [Publications] K.Yamazaki: "Amplified Polymorphic DNA(RAPD) for Rapid Identification of Spoilage Bacterium,Alicyclobacillus acidoterrestris." Biosci.Biotech.Biochem.61・6. 1016-1018 (1997)
• [Publications] 山崎浩司: "酸性飲料変敗菌 Alicyclobacillus acidoterrestrisの耐熱性とその制御" 食科工誌. 44・12. 905-911 (1997)
• [Publications] M.Murakami: "Alicyclobacillus acidoterrestris Spores in Different Thermal Resistance of Buffers and pH" Food Microbiol.15・6. 577-582 (1998)
• [Publications] B.kimura: "Evaluation of TaqMan^<TM> PCR Assay for Detecting Salmonella in Raw Mcat and Shrimp" J.Food Prot.62・3(印刷中). (1999)