1996 Fiscal Year Annual Research Report

電気泳動ゲル内各種蛋白質燐酸化酵素の検出法の確立と応用

Research Project

Project/Area Number	08557012
Section	試験
Research Institution	Asahikawa Medical College
Principal Investigator	藤澤仁旭川医科大学, 医学部, 教授 (10027039)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石田敦彦旭川医科大学, 医学部, 助手 (90212886) 亀下勇旭川医科大学, 医学部, 助教授 (60127941)
Keywords	ゲル電気泳動法 / アッセイ方法 / 蛋白質燐酸化酵素 / 蛋白質脱燐酸化酵素 / 合成基質ペプチド / シグナル伝達 / 蛋白質燐酸化反応 / 蛋白質脱燐酸化反応
Research Abstract	1.合成オリゴペプチドを基質に用いた電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素の検出法の開発。我々が1989年に報告した電気泳動ゲル内蛋白質燐酸化酵素検出法は極めて引用率の高い優れた方法として世界中の研究者によって利用されてきた。しかしこの方法はゲル内に固定する基質として蛋白質を用いており、各種の蛋白質燐酸化酵素の基質蛋白質をゲル内に固め込む程の量を精製し準備することは困難で、実際上限られた蛋白質しか使えないという難点あがった。そこで我々は各種の合成ペプチドをゲル内に固定し蛋白質燐酸化酵素の基質として用いる方法を検討した結果、各種の合成オリゴペプチドをポリリジンに共有結合させると、ゲル内に効率よく固定できまた蛋白質燐酸化酵素の基質として効率よく利用されることが明らかになった。しかも各種の蛋白質燐酸化酵素の基質となるコンセンサス配列を持ったオリゴペプチドはその特異性を維持している。オリゴペプチドは配列を自由に選んで合成できるし、モル濃度も蛋白質に比べれば自由に選択できるので、この方法は組織中の各種の蛋白質燐酸化酵素を解析するのに極めて優れた方法として今後汎用されることが期待される。 2.電気泳動ゲル内蛋白質脱燐酸化酵素の検出法の開発。ポリリジンに結合させた合成オリゴペプチドを蛋白質燐酸化酵素で燐酸化し、この燐酸化されたペプチドをゲル内に固定して蛋白質脱燐酸化酵素を検出する方法を開発した。蛋白質脱燐酸化酵素の研究は燐酸化酵素に比べると遅れており、これまでに明らかにされている脱燐酸化酵素の数も燐酸化酵素に比べると極めて僅かである。組織粗抽出液中の蛋白質脱燐酸化酵素を直接解析できる本方法は今後蛋白質脱燐酸化酵素の研究を飛躍的に進める可能性を秘めている。

Research Products

(16 results)

All Other

All Publications (16 results)

[Publications] K.Yoshida: "Differential Distribution of CaM Kinases and Induction of c-fos Expression by Flashing and Sustained Light in Rat Retinal Cells" Inv.Ophthalmol.Vis.Sci.37・1. 174-179 (1996)
[Publications] A.Ishida: "Evidence that autophosphorylation at Thr-286/Thr-287 is required for full activation of calmodulin-dependent protein kinase II" Biochim.Biophys.Acta. 1311. 211-217 (1996)
[Publications] Y.Nakamura: "Distribution of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase kinase α in the rat central nervous system : an immunohistochemical study" Neuroscience Letters. 204・1.2. 61-64 (1996)
[Publications] S.Watanabe: "Inactivation of calmodulin-dependent protein kinase IV by autophosphorylation of serine 332 within the putative calmodulin-binding domain" J.Biol.Chem.271・12. 6903-6910 (1996)
[Publications] S.Okuno: "Evidence for the Existence of Ca^<2+>/Calmodulin-Dependent Protein Kinase IV Kinase Isoforms in Rat Brain" J.Biochem.119・6. 1176-1181 (1996)
[Publications] I.Kameshita: "Detection of Protein Kinase Activities toward Oligopeptides in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel" Anal.Biochem.237・2. 198-203 (1996)
[Publications] A.Shimomura: "Calmodulin-dependent Protein kinase II Potentiates Transcriptional Activation through Activating Transcription Factor 1 but Not cAMP Response Element-binding Protein" J.Biol.Chem.271・30. 17957-17960 (1996)
[Publications] R.Sugai: "Molecular Cloning of a Novel Protein Containing the Association Domain of Calmodulin-Dependent Protein Kinase II" J.Biochem.120・4. 773-779 (1996)
[Publications] S.Okuno: "Purification and Characterization of Ca^<2+>/Calmodulin-Dependent Protein Kinase Kinase β from Rat Cerebellum" J.Biochem.121. 155-160 (1997)
[Publications] I.Kameshita: "Detection of Protein Phosphatase Activities in SDS-Polyacrylamide Gel Using Peptide Substrates" Anal.Biochem.(in press).
[Publications] T.Kitani: "Studies on the Site of Phosphorylation of Ca^<2+>/Calmodulin-Dependent Protein Kinase (CaM-Kinase) IV by CaM-Kinase Kinase" J.Biochem.(in press).
[Publications] 石田敦彦: "Clinical Neuroscience" 中外医学社, 4 (1996)
[Publications] 奥野幸子: "生化学" 日本生化学会, 5 (1996)
[Publications] 亀下勇: "生化学" 日本生化学会, 4 (1996)
[Publications] H.Fujisawa: "ELSEVIER" Integrative and Molecular Approach to Brain Function, 4 (1996)
[Publications] 奥野幸子: "蛋白質・核酸・酵素" 共立出版, 6 (1997)

1996 Fiscal Year Annual Research Report

電気泳動ゲル内各種蛋白質燐酸化酵素の検出法の確立と応用

Principal Investigator

藤澤 仁 旭川医科大学, 医学部, 教授 (10027039)

Research Products

[Publications] K.Yoshida: "Differential Distribution of CaM Kinases and Induction of c-fos Expression by Flashing and Sustained Light in Rat Retinal Cells" Inv.Ophthalmol.Vis.Sci.37・1. 174-179 (1996)

[Publications] A.Ishida: "Evidence that autophosphorylation at Thr-286/Thr-287 is required for full activation of calmodulin-dependent protein kinase II" Biochim.Biophys.Acta. 1311. 211-217 (1996)

[Publications] Y.Nakamura: "Distribution of Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase kinase α in the rat central nervous system : an immunohistochemical study" Neuroscience Letters. 204・1.2. 61-64 (1996)

[Publications] S.Watanabe: "Inactivation of calmodulin-dependent protein kinase IV by autophosphorylation of serine 332 within the putative calmodulin-binding domain" J.Biol.Chem.271・12. 6903-6910 (1996)

[Publications] S.Okuno: "Evidence for the Existence of Ca^<2+>/Calmodulin-Dependent Protein Kinase IV Kinase Isoforms in Rat Brain" J.Biochem.119・6. 1176-1181 (1996)

[Publications] I.Kameshita: "Detection of Protein Kinase Activities toward Oligopeptides in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel" Anal.Biochem.237・2. 198-203 (1996)

[Publications] A.Shimomura: "Calmodulin-dependent Protein kinase II Potentiates Transcriptional Activation through Activating Transcription Factor 1 but Not cAMP Response Element-binding Protein" J.Biol.Chem.271・30. 17957-17960 (1996)

[Publications] R.Sugai: "Molecular Cloning of a Novel Protein Containing the Association Domain of Calmodulin-Dependent Protein Kinase II" J.Biochem.120・4. 773-779 (1996)

[Publications] S.Okuno: "Purification and Characterization of Ca^<2+>/Calmodulin-Dependent Protein Kinase Kinase β from Rat Cerebellum" J.Biochem.121. 155-160 (1997)

[Publications] I.Kameshita: "Detection of Protein Phosphatase Activities in SDS-Polyacrylamide Gel Using Peptide Substrates" Anal.Biochem.(in press).

[Publications] T.Kitani: "Studies on the Site of Phosphorylation of Ca^<2+>/Calmodulin-Dependent Protein Kinase (CaM-Kinase) IV by CaM-Kinase Kinase" J.Biochem.(in press).

[Publications] 石田敦彦: "Clinical Neuroscience" 中外医学社, 4 (1996)

[Publications] 奥野幸子: "生化学" 日本生化学会, 5 (1996)

[Publications] 亀下勇: "生化学" 日本生化学会, 4 (1996)

[Publications] H.Fujisawa: "ELSEVIER" Integrative and Molecular Approach to Brain Function, 4 (1996)

[Publications] 奥野幸子: "蛋白質・核酸・酵素" 共立出版, 6 (1997)

藤澤仁旭川医科大学, 医学部, 教授 (10027039)