臨床臓器移植ドナーとしてのトランスジェニックブタの作成

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08557069
• Section: 試験
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 高木 弘 名古屋大学, 医学部, 教授 (70154755)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡田 秀親 名古屋市立大学, 医学部, 教授 (30160683) ; 林 衆治 名古屋大学, 医学部, 助手 (30218573) ; 横山 逸男 名古屋大学, 医学部, 講師 (60240206) ; 鬼頭 純三 名古屋大学, 医学部, 教授 (60022802) ; 村松 喬 名古屋大学, 医学部, 教授 (00030891)
• Keywords: 異種移植 / 遺伝子制御 / トランスジェニックブタ / ノックアウト動物 / α1.3GT / α1.2FT

Research Abstract

免疫抑制剤の進歩による、臓器移植の成績は飛躍的に向上してきている。それに伴い、臓器移植の適用の範囲も、驚異的に拡大し、急激なドナー不足の状態が欧米を中心に実現している。そのため、動物の臓器をヒトに異色する異種臓器移植が注目を集めている。ブタをドナーとする異種移植で発生する、超急性拒絶反応を抑制するために、2つの手段を考えられる。第1はヒト補体制御因子(DAF,IIRF20)遺伝子の導入であり、第2は、主要異種抗原GALαGALを誘導する酵素α(1,3)galactosyl transferase (α1.3GT)の発現抑制である。α1.3GT遺伝子の発現を抑制する手法として、(1)α1.3GT遺伝子のノックアウト、(2)α(1.2)frcosyltransferase (α1.2FT)遺伝子の導入が考えられる。我々は、マウスembryonic stem(ES)細胞を用いて、マウスα1.3GT遺伝子をノックアウトするためのノックアウトベクターを作成し、このベクターをelectroporarion法でマウスES細胞に導入した。このES細胞をG418を用いて選択し、サザンブロット、ノザンブロット、FACSにてα1.3GT遺伝子の発現を解析した。このα1.3GTノックアストマウスES細胞では、GALαGAL抗原の発現が抑制され、しかもヒトIga及びIgMを結合の抑制されることが確認できた。これらの結果をもとに、現在ノックアウトマウスを作成中である。α1.2FT遺伝子をブタ受精卵に遺伝子導入しトランスジェニックブタ作成を行った。この遺伝子導入ブタの白血球及び上皮細胞を用いてα1.2FTの発現をRTPCR及び蛍光免疫染色にて確認した。トランスジェニックブタにおいてα1.2FT遺伝子の発現の確認に成功した。現時点ではα1.2FT遺伝子導入トランスジェニックブタの発育及び成長に与える影響が検討されている。ブタα1.3GT遺伝子は最近欧米でクローニングされた。我々はこの結果をもとにしてブタα1.3GT遺伝子の詳細な解析を行った。現時点ではブタα1.3GTの発現において4種類のalternative splicingが確認されている。またブタα1.3GTのcatalytic domainはエクソン9にあることが確認された。我々はこの結果をもとにブタα1.3GT遺伝子をノックアウトするノックアウトベクターを作成した。次にα1.3GTの発現を抑制し、しかもブタα1.2FTの遺伝子を導入する最も理想的な方法として近年注目を集めているα1.2FT遺伝子ノックインベクターを作成した。このベクターは従来用いられているノックアウトベクターのselection markerネオマイシン耐性遺伝子の代わりにα1.2FT遺伝子を導入する。ES細胞でいでんし導入後α1.2FT遺伝子導入された細胞はヒト血清による補体依存性細胞障害活性を受けないという特徴を用いてヒト血清によって選択する。選択された細胞はα1.3GTをノックアウトし、しかもα1.2FT遺伝子を導入された細胞ということになる。現在のベクターを用いて、我々はマウスES細胞に遺伝子導入を行い、ノックインされたマウスES細胞を選択している。今後これらの研究結果をもとに、さらに完成度の高いGALαGALの発現が抑制されたトランスジェニックブタを作成する予定である。

Research Products

• [Publications] Takagi H: "Evidence that Double Transfection to Xenoendothelial Cells Using GPI-Anchoring Complement Regulatory Factor 8 Decay" Proceedings. 27(1). 330- (1995)
• [Publications] Takagi H: "How can human DAF and HFR20 prevent hyperacute rejection in transgenic mice?" Transplant Troc. 28(2). 599-600 (1996)
• [Publications] Takagi H: "In vitro and in vivo investigation ofthe anti-complement agents,FUT-175 and K76COOH,in the prevention of hyperacute rejection following discordant" Xenotransplantation. 3(3). 237-245 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Protection of guinea pig cells transfected with 5I2 gene from complement dependent cytolysis of rat." Transplant Proc. 3. 217-221 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Introduction of α(1,2) fucosyltransferase and its effect on α-Gal epitopes in transgenic pig." Xenotransplantation. 3. 81-86 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Liberation of vasoactive substances and its prevention with thromboxane A2 synthase inhibitor in pig liver transplantation." Transplant International. 9. 76-81 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Elucidation of rejection mechanisms using the splenocyte injection model in concordant xenotransplantation." Transplantation Proceedings. 27. 1883-1884 (1995)
• [Publications] Takagi H: "Effect of tetrahydropyranyladriamycin on concordant xenotransplantation in the splenocyte injection and heart transplantation model." Transplantation Proceedings. 27. 1628-1629 (1995)
• [Publications] 高木弘: "遺伝子制御による異種移植" 臨床科学. 31. 862-867 (1995)
• [Publications] Takagi H: "Evidence that double tranfection to xenoendothelial cells using GPI-anchoring complement regulatory factor (DAF and HRF20) genes is useful for the inhibition" Xenotransplantation. 2. 250-294 (1995)
• [Publications] 高木弘: "異種移植の展望" 今日の移植. 7(3). 193-198 (1995)
• [Publications] 高木弘: "異種移植の展望" 平成7年度名古屋大学公開講座「生命を考える」. 66-70 (1995)
• [Publications] Takagi H: "臓器移植と遺伝子操作-異種移植の免疫抑制" BIO Clinica. 10(10). 735-737 (1995)
• [Publications] 高木弘: "異種移植臨床への研究" BIO Clinica. 10(14). 1064-1066 (1995)
• [Publications] Okada H: "Antagonistic peptides against human anaphylatoxin C5a." Immunology. 86. 149-154 (1995)
• [Publications] Okada H: "Tubulointerstitial injury induced in rats by a monolonal antibody which inhibits function of a membrane inhibitor of complement." J.Clin.Inv.96. 2348-2356 (1995)
• [Publications] 高木弘: "遺伝子制御による異種移植" 臨床科学. 1. 862-867 (1995)
• [Publications] 林衆治: "治療用遺伝子導入種血管内皮細胞を用いたハイブリツド型人工血管作成に関する研究" 人工臓器. 24(3). 834-837 (1995)
• [Publications] Takagi H: "Beneficial effect of donor pretreatment with thromboxane A2 synthase inhibitor on the graft survival in pig liver transplantation" Journal of Surgical Research. 60. 238-239 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Human superoxide dismutase cDNA transfection and its in vitro effect on cold preservation" Biochemical and biophysical research commumunications. 218. 653-657 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Inhibition of human complement-dependent cell lysis by bovine aortic endothelial cells transfected with menbrane-bound complement-regulatory" European Surgical Research. 28. 440-446 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Retrovirus-mediated human superoxide dismutase cDNA transfer to prevent Ischemia-reperfusion injuly" Transplantation Proceedings. 28(1). 342- (1996)
• [Publications] Takagi H: "Measurement of the ratio of superoxide-scavenging activity in the graft in swine liver transplantation" Transplantation Proceedings. 28(1). 329- (1996)
• [Publications] Takagi H: "Tissue distribution of GALα(1,3)GAL epitope in heart,kidney,and liver of pig and mouse" Transplantation Proceedings. 28(1). 216- (1996)
• [Publications] Takagi H: "Decreased Fas antigen expression of the cultured hepatocytes with FK506" Transplantaiton Proceedings. 28(6). 3189-3190 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Establishment of a Human DAF/HRF20 Double Transgenic MOuse LIne is not Sufficient to Suppress Hyperacute Rejection" Surg Today. 26. 993-998 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Tetrahydropyranyladriamycin with FK506 combination therapy for hamster-to-rat-concordant xenotransplantation." Transplant Proc. 28. 709-710 (1996)
• [Publications] Takagi H: "Effect of antisense ribozyme to pit α(1,3) galactosyl transferase gene on the expression of Galα(1,3) Gal epitope." Transplant Proc. 28. 628- (1996)
• [Publications] 高木弘: "異種移植" 医学のあゆみ. 177(3). 258-259 (1996)
• [Publications] 高木弘: "異種臓器移植におけるトランスジェニックブタ作製の重要性" 細胞工学. 15(1). 81-89 (1996)
• [Publications] 高木弘: "異種移植への展望" 臨床透析. 12(3). 269-270 (1996)
• [Publications] 林衆治: "遺伝子制御による異種移植の研究" 日本消化器外科学会雑誌. 29(4). 907-910 (1996)
• [Publications] 高木弘: "免疫抑制剤シクロスポリン" 今日の移植. 9(4). 431-432 (1996)
• [Publications] 高木弘: "異種移植" 日本外科学会雑誌. 97(11). 1010-1017 (1996)
• [Publications] Okada H: "Local inflammation caused by a monoclonal antibody which blocks the function of the rat membrane inhibitor of C3 convertase." J.Immunol.156. 1182-1188 (1996)
• [Publications] Okada H: "Molecular cloning of murine decay accelerating factor (DAF) by immunoscreening." Int.Immunol.8. 279-285 (1996)