トランスジェニックブタを用いた糖尿病治療用インスリン分泌B細胞株の樹立

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08557071
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Section: 試験
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 一知 京都大学, 医学研究科, 助教授 (90168435)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 篠原 茂生 大塚製薬, 大津研究所, 主任研究員 ; 筏 義人 京都大学, 生体医療工学センター, 教授 (00025909) ; 宮崎 純一 東北大学, 加齢医学研究所, 教授 (10200156) ; 内海 恭三 京都大学, 農学部, 教授 (90033266) ; 今村 雅之 京都大学, 医学研究科, 教授 (00108995)
• Keywords: 糖尿病 / インスリン / B細胞 / トランスジェニック / ブタ / MIN6 / 移植 / 膵臓

Research Abstract

1.導入遺伝子の作製
(1)導入遺伝子の効率的な標的発現を検討するためマウスES細胞を用いた遺伝子導入マウス作成系を樹立した。発現調節領域としてヒトインスリンプロモーターをSV405抗原遺伝子に連結し導入遺伝子を作製した.今後、組織特異的発現を実現するため,必要に応じて5"末端または3"末端の近傍のイントロンの付加あるいはポリA付加シグナルを複数箇所に組み込む等の修飾を加えて導入遺伝子の発現効率を向上しうるかどうかを検討する.(2)MIN6において理想的な部位に組み込まれていると想定されるトランスジーンをクローニングするためにブドウ糖刺激に対して良好な反応性を保持した細胞を選択して増殖培養させ、この高反応性MIN6細胞よりできる限りintactなgenomicDNAを抽出した.今後、これよりトランスジーンをクローニングする予定である。これを導入遺伝子とすることによりブドウ糖濃度に依存的に反応してインスリンを分泌するインスリ-マを発現するトランスジェニックブタが高頻度に作出されることが期待される.
2.ブタ受精卵における導入遺伝子陽性胚選択技術の確立
(1)1.の(1)または(2)にて作製された導入遺伝子を用いて,導入遺伝子DNA発現確認技術として、ブタ前核期胚を胚盤胞まで発達させた後,バイオプシーを行って細胞を採取しそのDNAが胚に保持されているかどうかをPCRで調べて陽性胚を選択する技術を樹立した。今後、陽性胚のみをレシピエントの子宮に移植し個体を得る技術を開発する.最終的には(2)2.の(1)にて選択された陽性胚より発生した個体における導入遺伝子発現を検討し,このトランスジェニックブタの膵より得られたインスリノーマよりB細胞株を樹立する.

Research Products

• [Publications] Inoue K,Gu YJ,Hayashi H: "Pig-to-Rat xenotransplantation with mesh reinforced polyvinyl alccno : hydrogel bag : Efficacy of Agarose Gel" Transplant Proc. 28. 1422-1423 (1996)
• [Publications] Hayashi,H.Inoue,K.Aung,T.Tun,T.Gu,YJ: "Application of a novel B cell line MIN6 to mesh reinforced polvvinvl alcohol hvdroael tube and agarose microcapsule ; An vitro study" Cell Transplantation. 5. s65-s69 (1996)
• [Publications] T.Kaido,S.Yamaoka,M.Imamura: "Continuous HGF supply from HGF-expressing fibroblasts transplanted into spleen prevents CCI-4-induced acute liver injury in rats" Biochemical and Biophysical research communications. 218. 1-5 (1996)