顎顔面発生制御遺伝子同定のためのマイクロサブトラクションライブラリー構築法の開発

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08557095
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 栗栖 浩二郎 大阪大学, 歯学部, 教授 (50028346)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 克彦 中外製薬(株), 研究者 ; 田畑 純 大阪大学, 歯学部, 助手 (20243248) ; 加藤 穣慈 大阪大学, 歯学部, 助手 (90243245) ; 岩本 容泰 大阪大学, 歯学部, 講師 (30223431) ; 脇坂 聡 大阪大学, 歯学部, 助教授 (40158598)
• Keywords: 顎顔面 / 遺伝子 / 遺伝子増幅 / ウサギ / 形態形成 / 発生 / 組織分化 / cDNAライブラリー

Research Abstract

本年度は、2種類の軟骨細胞特異的なSubtraction cDNA ライブラリーを作成し、それらの性能評価を行った。一つは、軟骨分化誘導したラットRMD細胞の一本鎖cDNAより未分化RMD細胞の一本鎖アンチセンスcDNAを差し引いて作成したSubtraction cDNA ライブラリーで、もう一つは、軟骨分化誘導したラットRMD細胞の二本鎖cDNAとビオチン化した未分化RMD細胞二本鎖cDNAを混合して、変性、ハイブリダイズした後、ストレプトアビジンビーズに吸着するcDNAを除くことにより作成したSubtraction cDNA ライブラリーである。両ライブラリーにおいて、軟骨細胞特異的なクローンの割合は約2割で、残りのクローンは、量的に差があるものの分化誘導したRMD細胞および未分化RMD細胞両方で発現が検出された。しかし、ライブラリー作成に必要な最低限のmRNA量は、前者と後者でそれぞれ1mgと30ngであり、後者のほうが圧倒的に少ない材料でライブラリーを作成できることがわかった。さらに、このライブラリーに含まれる遺伝子100クローンについて構造解析と発現パターンの解析を行ったところ、約8割のクローンは、細部骨格関連あるいは、細胞外基質のもので、1割は、成長因子や、代謝酵素、転写調節因子であった。残りのクローンは、これまでに報告されていないものであった。また、得られたcDNAの平均的な長さは、約550baseで、殆どのクローンの70%以上の部分は3'側の非翻訳領域を含んでいた。これらの結果より、今回検討した、Subtraction cDNA ライブラリー作成法は、微量の生体材料でも作成可能であるが、全長のクローンを得るためには、Subtraction cDNAをプローブにして、元の出発材料が由来するWhole embryoのライブラリーをスクリーニングするなどの工夫が必要であると考えられた。

Research Products

• [Publications] J.G.Liu: "Dvelopmental role of PTHrP in the murine molars." Europ.J.Oral Sci.(in press). (1998)
• [Publications] S.H.Youn: "Growth-associated protein-43 (GAP 43) in the regenerating periodontal Ruffini endings of the rat incisor following injury of the inferior alveolar nerve." Brain Res.(in press). (1998)
• [Publications] Y.Miyawaki: "Calbindin D28K-like immuno-reactivity in the developing and degenerating circumvallate papilla of the rat." Cell Tssue Res.(in press). (1998)
• [Publications] K.Kurisu: "Human genes for dental anomalies." Oral Dis.3. 223-228 (1998)
• [Publications] T.Inai: "Immunohistochemical localization of connexin 43 in the enamel organ of the rat upper incisor during ameloblast development." Arch.Histol.Cytol.60. 297-306 (1997)
• [Publications] T.Nakamura: "Induction of osteogenic differentiation by hedgehog proteins." Biochem.Biophys.Res.Commun.237. 465-469 (1997)
• [Publications] M.Enomoto-Iwamoto: "Bone morphogenetic protein signaling is required for maintenance of differentiating activity,cessation of proliferation and terminal differentiation of chondrocytes." J.Cell Biol.40. 409-418 (1998)
• [Publications] N.Kinto: "Fibroblasts expressing sonic hedgehog induce osteoblast differentiation and proliferation of chondrocytes." Febs lett.404. 319-323 (1997)
• [Publications] M.Enomoto-Iwamoto: "Involvement of α5β1 integrin in matrix interactions and proliferation of chondrocytes." J.Bone Miner.Res.(in press). (1997)
• [Publications] Y.Miyawaki: "Calbindin D28k-like immunoreactive nerve fibers in the predentin of rat molar teeth." Archs.oral Biol.42. 773-777 (1997)
• [Publications] S.H.Youn: "Regeneration of periodontal primry afferents of the rat incisor following injuru of the inferior alveolar nerve with special reference to neuropeptide Y-like immunoreactive primary afferents." Brain Res.752. 161-169 (1997)