ヒトG蛋白共役型薬物受容体サブタイプ遺伝子の創薬への応用

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08557148
• Research Institution: National Research Institute for Child Health and Development
• Principal Investigator: 辻本 豪三 国立小児病院, 小児医療研究センター・小児薬理研究部, 部長 (80172013)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 修司 大塚製薬株式会社, 徳島新薬第二研究所, 研究員 ; 殊才 孝則 大塚製薬株式会社, 徳島研究所, 研究員 ; 高田 達之 国立小児病院, 小児医療研究センター・小児薬理研究部, 科学技術庁重点研究支 ; 武井 義則 国立小児病院, 小児医療研究センター・小児薬理研究部, 科学技術庁重点研究支 ; 平澤 明 国立小児病院, 小児医療研究センター・小児薬理研究部, 研究員 (70242633)
• Keywords: G蛋白質共役型受容体 / α1アドレナリン受容体サブタイプ / Green Fluorecent Protein / 可視化技術 / 共焦点顕微鏡

Research Abstract

【目的】G蛋白質共役型受容体は一つの遺伝子ファミリーを形成する。本研究では、ヒトの新規受容体サブタイプ遺伝子をクローニングし、培養細胞に受容体遺伝子を導入・発現させた安定発現細胞株を作製し、その単一受容体発現細胞を用い受容体サブタイプの細胞内情報伝達機構を解析、更に特異的な作動薬ね拮抗薬を開発し、また得られた特異的薬物を用い、生体内標的臓器における各受容体サブタイプの生理作用を検討する事を計画した。具体的には、近年複数のサブタイプが存在することが知られてきているα1アドレナリン受容体をモデル系として用い、この創薬ストラテジーの検証・確立を目的とした。
【結果】各種サブタイプ受容体遺伝子をヒトでクローニングし、その遺伝子安定発現細胞を作成し、受容体構造、情報伝達機構を検討した。更に、これらα1アドレナリン受容体サブタイプ受容体安定発現細胞を用い、各種α1アドレナリン受容体選択拮抗薬をスクリーニングした。更に、CECが極めて親水性の高い特性から、細胞膜表面の受容体のみを不活化するとの仮説に基づき、α_<1A>受容体ならびにα_<1B>受容体遺伝子のN端にFLAG-tag、またはC端にGreen Fluorecent Proteinを組み込んだ受容体遺伝子を作製し、蛍光抗体ならびに蛍光リガンドを用いフローサイトメトリー解析、共焦点顕微鏡による画像解析を行い、α_<1A>受容体は主として細胞内に、α_<1B>受容体は細胞膜表面に多く存在すること、又親水性の高いCECはサブタイプに関わらず、細胞表面に存在するα_1アドレナリン受容体蛋白を不活化し、各サブタイプ受容体蛋白の細胞内局在の相違がCEC感受性を決定していることを明らかとした。
【考察】ヒトの3種類のα1アドレナリン受容体(A,B,D型)をクローニングし、安定発現細胞を用い新規α1Aアドレナリン受容体選択的拮抗薬KMD-3413を見出した。また、共焦点顕微鏡を用いた、受容体の細胞内局在検出系による可視化技術を確立し、受容体蛋白の細胞内局在が薬物作用を考える上で非常に重要であることを示した。
【結論】本研究では、G蛋白質と共役する受容体の代表であり、近年複数のサブタイプが存在することが知られてきているα1アドレナリン受容体をモデル系として用い、一般的創薬へのストラテジーを検証・確立することを目的としたが、この方法論により実際治療に役立つと考えられる薬物のスクリーニングが可能であることが証明された。また、α1受容体サブタイプの生理的意義を知り、受容体蛋白の細胞内局在等を解析する可視化細胞生物学アプローチにより薬物治療上有用な情報が得られることが期待される。

Research Products

• [Publications] Nakayama Y,et al.: "Modulation of the arterial baroreceptor reflex by the vasopressin receptor in the area postrema of the hypertensive rats." Neuroscience Letters. 226. 179-182 (1997)
• [Publications] Takada T,et al.: "Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker." Nature Biotech.15. 458-461 (1997)
• [Publications] Fukuhara C,et al.: "Day-night variation of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP)level in the rat suprachiasmatic nucleus." Neuroscience Letters. 229. 49-52 (1997)
• [Publications] Hirasawa A,et al.: "Subtype-specific differences in subcellular localization of α1-adrenoceptors(ARs):Chlorethy1-clonidine preferentially alkylates the accessible cell surface α1-ARs irrespective of the subtype." Mol.Pharmacol.52. 764-770 (1997)
• [Publications] Moriyama N,et al.: "Quantification and distribution of a1-adrenoceptor subtype mRNAs in human vas deferens:comparison with those of epididymal and pelvic protions." Bri.J.Parmacol.122. 1009-1014 (1997)
• [Publications] 辻本豪三、他: "薬理学の新しい研究領域:ファルマインフォマティックス" 日本薬理学会誌. 110. 31-36 (1997)
• [Publications] 辻本豪三(編著): "α交感神経受容体の分子治療学-遺伝子から機能へ-" メディカルレビュー社, 25 (1997)
• [Publications] 平澤明、辻本豪三: "生体の科学:受容体1997-Gタンパク質共役型受容体:アドレナリン受容体" (財)金原一郎記念医学医療振興財団, 5 (1997)