超微量蛋白質アミノ酸配列分析用マルチ気相化学反応装置の開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08558071
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Section: 試験
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高尾 敏文 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教授 (10197048)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福田 宏之 日本パーセプティブ(株), 技術開発課, 課長 ; 今本 尚子 大阪大学, 医学部, 助手 (20202145) ; 下西 康嗣 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (00029951)
• Keywords: 微量蛋白質 / アミノ酸配列 / 気相化学反応装置 / 特異的化学分解 / 耐蝕・耐圧性反応槽 / マルチ試料プレート / 質量分析

Research Abstract

多数の微量蛋白質を汚染することなく一度に化学分解するために、強酸及び有機溶媒を気相で反応槽に導入、反応終了後に真空ポンプにより除去ができ、またこの一連の動作が繰り返し行なえる装置を設計、試作した。
まず、反応装置の基礎になる部分(試薬供給、反応槽)を試作し、検討した結果、試薬の反応槽への供給はガス圧によりループ内に一旦デリバリー、計量の後、予め真空ポンプにより粗引きした反応槽の印圧を利用して、ループ内の試薬を反応槽に導入する方式を考案した。これを基本に装置全体の構成を立案、試作した。概要を以下に列挙する。1)5種類の試薬と洗浄液をシーケンシャルに導入可能。2)系内のライン、電磁バルブ、6方バルブ、反応槽は耐酸、耐蝕性。3)反応槽は最高100℃迄(時間)制御可能で耐圧性。また、反応槽内の様子は覗き窓から観察できる。4)質量分析用試料プレート(46×48mmのサイズで試作、一枚のプレート上に最大60種の試料を塗布可能)を最大4枚まで反応槽内に導入可能。5)ピラニ-ゲージによる反応槽内の真空度の経時変化を記録できる。6)試薬の選択、導入、温度コントロール、不活性ガスの導入、真空ポンプによる減圧等の一連の動作を自由に制御するためのインターフェースボードを備えている。(→時間プログラムによる自動運転)
本装置を用いて行う化学反応として種々検討した結果、蛋白質由来のペプチド断片を特異的に産生させる化学分解として、2%酢酸水にる部分加水分解、及びギ酸雰囲気下で行うブロムシアン分解(メチオニン特異的切断)が、また、蛋白質の逐次アミノ末端アミノ酸配列分析を行うための試薬としては、メチルイソチオシアネート(カップリング試薬)、トリフルオロ酢酸(切断試薬)の組合わせが最も適していることがわかった。

Research Products

• [Publications] K.Yoshino et al.: "Identification of the Functional Region on the Superantigen Yersinia pseudotuberculosis-derived Mitogen Responsible for Induction of Lymphocyte Proliferation by Using Synthetic Peptides" FEBS Lett.390. 196-198 (1996)
• [Publications] T.Takao et al.: "Sensitive Analysis of Oligosaccharides Derivatized with 4-Aminobenzoic Acid 2-(Diethylamino) ethyl Ester by Matrix-assisted Laser Desorption/lonization Mass Spectrometry" Rapid Commun.Mass Spectrom.10. 637-640 (1996)
• [Publications] K.Kishimoto et al.: "Suicide Inactivation of Porcine Leukocyte 12-Lipoxygenase Associated with Its Incorporation of 15-Hydroperoxy-5,8,11,13-eicosatetraenoic Acid Derivative" Biochim.Biophys.Acta. 1300. 56-62 (1996)
• [Publications] T.Shimizu et al.: "A Covalently Cross-Linked Histone Heterodimer in Starfish" Nature. 380. 32-32 (1996)
• [Publications] O.Shouno et al.: "Preparation and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific for Lauroylated Isoform of Bovine Transducin a-Subunit : Immunohistochemical Analysis of Bovine Retinas" J.Neurochem.66. 2188-2196 (1996)
• [Publications] J.Gonzalez et al.: "Effect of the Position of a Basic Amino Acid on C-Terminal Rearrangement of Protonated Peptides Upon Collision-induced Dissociation" J.Mass Spectrom.31. 150-158 (1996)
• [Publications] 高尾敏文: "磁場型質量分析を用いた蛋白質のキャピラリーHPLC/エレクトロスプレーイオン化質量分析" 日本医用マススペクトル学会サ-キュラー. No.36. 1-6 (1996)
• [Publications] 高尾敏文: "質量分析によるタンパク質の構造解析" 生化学. 68. 1-13 (1996)
• [Publications] 高尾敏文分担: "新生物化学実験のてびき2-タンパク質の分離・分析と機能解析法-" 化学同人, 150 (1996)