タンパク質refoldingの機構解明と連続操作への固定化法の適用

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08650951
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575) ; 黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204) ; 酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
• Keywords: タンパク質 / リフォールディング / 固定化法

Research Abstract

1.タンパク質としてサブチリシンを採用した。CNBr-activated Sepharose 4Bゲルにタンパク質のアミノ基で固定化する方法と、EAH-Sepharose 4Bゲルにタンパク質のカルボキシル基で固定化する方法の2つの固定化法を試みた。固定化タンパク質量や固定化後の保持活性などについて固定化反応におけるタンパク質濃度の影響を調べた。固定化効率および保持活性ともアミノ基固定の方が優れており、0.1mg/ml-gel以下のタンパク質濃度では100%がゲルに固定化され、保持活性は50-70%であった。
2.固定化サブチリシンの変性操作は、この酵素が中性付近では6 M Guanidinium Chloride (GdmCl)で変性さそうとすると、たちまちAutolysisがおこり断片化してしまうことを考慮してpHを2程度に下げた後6 M GdmClで変性させた。もちろんこの状態では活性は発現しないし、また、この状態からpHを中性付近にシフトさせ、さらにGdmClを除去しても活性は全く回復しない。
3.こうした変性状態から、固定化しないrefolding系でかなりの効果のあった2 M酢酸カリウム溶液を適用すると約80%の活性が回復し、さらに、この変性と再生の操作を2, 3回繰り返すと、その後はいつも安定した定量的refoldingが達成できることがわかった。
4.これらとは別に、固定化すべき適切な阻害剤等の候補としてトリプシンインヒビターやフォスフォラミドン(サーモライシン用)などを採り上げそれらの阻害の様子を調査、検討中である。
5.こうした実験における酵素の活性測定やrefoldingしてきた酵素の活性回復率の測定は酵素による基質の分解速度で定量しており、購入した紫外分光光度計を用いている。

Research Products

• [Publications] Daisuke Nohara: "A new method of media selection for protease refolding by application of immobilized subtilisin preparation" Journal of Fermentation and Bioengineering. 82・3. 315-318 (1996)
• [Publications] Daisuke Nohara: "Design of optimum refolding solution by combination of reagents classified by specific function" Journal of Fermentation and Bioengineering. 82・4. 401-403 (1996)
• [Publications] Daisuke Nohara: "Recent Research Developments in Chemical and Pharmaceutical Sciences" Research Signpost (Trivandrum. India), (1996)