タンパク質refoldingの機構解明と連続操作への固定化法の適用

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08650951
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575) ; 黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204) ; 酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
• Keywords: タンパク質 / リフォールディング / 固定化法

Research Abstract

(1) Streptomyces griseus 由来のトリプシン(SGT)を固定化すべき酵素として採用した。アガロースゲル(CNBr-activated Sepharose 4B)にSGTを固定化し、ジチオスレイトール(DTT)およびグアニジン塩酸塩(GdmCl)で変性還元後、これをリフォールディングさせた。この変性還元・再生操作を繰り返すたびに固定化SGTの活性回復率は減少していき、以前行ったsubtilisin BPN'やthermolysinの場合のように定量的なりリフォールディングができなかった。アガロースゲルの代わりにガラスビーズ(controlled pore glass:CPG)を用いてSGTを固定化し同様の変性還元・再生操作を行うと、定量的リフォールディングが可能となり、リフォールディング溶媒の定量的評価に使えることとなった。定量的リフォールディングのできる固定化プレパレーションはオートリシスやアグリゲーションといった分子間相互作用を排除でき、そのタンパク質特有のリフォールディングに対して有効な溶媒が選定でき、リフォールディングの機構解明にとっても大切である。
(2) ベンザミジンによるSGTの阻害関係を調べた結果、Ki値は10^<-4>M程度であった。
(3) SGTにベンザミジンを働かせた状態でのSGTの固定化では、アガロースゲルへの固定化において、保持活性を約20%上昇させることができた。
(4) 固定化ベンザミジンをSGTのリフォールディング系に共存させた場合、タンパク質濃度が0.25mg/mlのとき、非共存の場合と比べて5割程度リフォールディング収率が上昇した。
(5) とくに、固定化ベンザミジンをSGTのリフォールディング系に共存させて収率が大幅に上昇したことは、カラム操作などによる念願の連続的フォールディング系の設計が可能となったと思われる。

Research Products

• [Publications] Daisuke Nohara: "The Possibility of the Direct Measurement of Micelle Weight by Electrospray Ionization Mass Spectrometry" Rapid Communication in Mass Spectrometry. 12. 1933-1935 (1998)
• [Publications] Daisuke Nohara: "High Performance in Refolding of Streptomyces griseus Trypsin by the Aid of a Mutant of Streptomyces Subtilisin Inhibitor Designed as.." Journal of Biochemistry. 125(2). 343-347 (1999)
• [Publications] Daisuke Nohara: "Kinetic Study on Thermal Denaturation of Hen Egg-White Lysozyme Involving Precipitation" Journal of Bioscience and Bioengineering. 87(2). 199-205 (1999)
• [Publications] Daisuke Nohara: "Recent Research Developments in Fermentation and Bioengineering" Research Signpost (Trivandrum, India) (分担), (1998)