1996 Fiscal Year Annual Research Report
植物ウイルス、ウイロイドの新しい遺伝子診断法の開発
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08660046
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
佐野 輝男 弘前大学, 農学部, 助教授 (30142699)
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| Keywords | 遺伝子診断 / マイクロプレートハイブリダイゼーション / ウイルス / ウイロイド |
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| Research Abstract |
1.マイクロプレートハイブリダイセーション(以下MPH)に基づく遺伝子診断法の実用化上キ-ポイントとなる以下の諸条件の検討を行なった。なお、ウイロイドではホップ矮化ウイロイド(HSVd)とカンキツエクソコーティスウイロイド(CEVd)を、ウイルスではキュウリモザイクウイルス(CMV)を用いた。
(1)、マイクロプレートへの被検核酸分子の吸着条件の検討;マイクロプレートに被検核酸分子を効率良く吸着させ検出感度を上げる条件を検討した結果、被検試料の変性方法、特にホルムアミド、ホルムアルデヒド濃度が吸着に大きく影響した。変性はホルムアミド50%、ホルムアルデヒド6.125%-1X SSC中で68C、10分の加熱が最も優れていた。
(2)、ハイブリダイセーション条件の検討;上記の条件で変成させた試料につき諸々のハイブリダイセーション条件の検討を行なった結果、デキストラン硫酸ナトリウム濃度が検出感度に大きく影響し、至適濃度は5-10%であった。また、従来のメンブレンを用いた手法に比べプレハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイゼーション液中のブロッキング試薬(tRAN,salmon sperm DNA)等を省略でき、手法を簡便化できた。
(3)、検出用プローブの非放射性標識方法の検討;ジゴキシゲニン(DIG)標識したcRNAプローブで、特に高価な発光試薬を用いることなく安価なp-ニトロフェニル燐酸2ナトリウムの発色で、メンブレンを用いる従来型の手法とほぼ同程度の検出感度が得られ、診断コストの低下を達成できた。
2、植物ウイルス、ウイロイド診断用プローブの開発を行ない、ウイロイドではHSVd,CEVdの他、ASSVd、PBCVd、PSTVd、HLVd、CbVd1、GYSVdの8種類、ウイルスではCMVの他HLV、TuMV、WCMVの4種類を作成した。
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