動物細胞に導入した巨大遺伝子領域の増幅・発現とその核内挙動の解析

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08660104
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 奥村 克純 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (30177183)
• Keywords: DNA replication / FISH / YAC / MDR / gene amplification / replicon

Research Abstract

本研究は、遺伝子導入を行ったDNAおよび、内在性DNAの巨大DNA領域の遺伝子増幅・発現と核内挙動を蛍光in situ hybridization(FISH)法を用いて視覚的に明示することを目的として研究を行った。まず、相同組換えを利用して導入した遺伝子の正しい導入の確認、機能付与のために生物種の異なる遺伝子を導入した場合の導入部位の同定をFISH法を用いて行うための予備実験としてスライドガラス上に培養した細胞をそのまま固定し、巨大DNAをプローブとしてFISHを行ったところ、効率よくFISHシグナルを検出することに成功した。同時に、固定操作時に細胞の剥離もあり、特に浮遊細胞系ではポリリジンでコートしたスライドを用いてもロスが多いことから、細胞ロスのない固定法を必要とすることがわかった。すなわち、導入遺伝子の検出法は確立したが、今後一細胞レベルでの効率的迅速解析法の確率が必要である。一方、多剤耐性遺伝子(MDR)ゲノム領域の増幅はdouble minute(DM)タイプで、特にMDRを含む部位の増幅度が大きく、さらのその周辺1MB前後のゲノム領域におよぶが、YACを用いたマルチカラーFISHによって増幅度の異なるゲノム領域を検出した。また、DMタイプの増幅物の細胞核内分布は細胞周期に依存してある程度の規則性があることが推定されたが、付着系の細胞系であるため細胞周期ごとの分画が困難であり、また多剤耐性遺伝子を含んでいるので細胞の同調が困難であるため、個々の細胞周期でのDMの核内配置について結論を出すには至らなかった。また、共焦点レーザー顕微鏡は検出波長により感度的に問題がある点、検出色の数にも制限があるため、高感度CCDカメラ三次元解析システムの導入を含めて検討する必要がある。また、ヒトMHC領域のクラスIIとクラスIIIは別々のレプリコンクラスターにあることを血球系の細胞を用いた複製タイミングの解析から推定したが、核内で検出されるレプリコンクラスターは、細胞腫によって異なることがわかり、FISH操作によっても検出されるクラスターの形状が変化する等今後の検討が必要である。

Research Products

• [Publications] Nobuhisa Mizuki: "Isolation of cDNA and Genomic Clones for a Human Ras-related GTP-Bindings Protein and Its Chromosomal Localization to the Long Arm of Chromosome 7,7q36." Genomics. 34巻. 114-118 (1996)
• [Publications] Yoshinari Makino: "Structural and Functional Analysis of the Human Y-Box Binding Protein(YB-1)Gene Promoter." Nucleic Acid Research. 24巻. 1873-1878 (1996)
• [Publications] Ken Taniguchi: "A Human Canalicular Multispecific Organic Anion Transporter(cMOAT)Gene Is Overexpressed in Cisplatin-resistant Human Cancer Cell Lines with Decreased Drug Accumulation." Cancer Research. 56巻. 4124-4129 (1996)
• [Publications] Toshihiko Eki: "Mapping of the Human Homologue(ORC1L)of the Yeast Origin Recognition Complex Subunit 1 Gene to chromosome Band 1p32.2-p32.3." Genomics. 36巻. 559-561 (1996)
• [Publications] Yasunari Matsuzaka: "Isolation and Structural Analysis of the Mouse Nat(Ring3)gene in the MHC Class II Region." Nucleic Acids Symposium Series. 35巻. 225-226 (1996)
• [Publications] Toshihiko Eki: "Assignment of the Closest Human Homologue(DNA2L;KIAA0083)of the Yeast Dna2 Helicase Gene to Chromosome Band 10q21.3-q22.1." Genomics. 37巻. 408-410 (1996)
• [Publications] Mami Hata: "Genomic Cloning of a Human Heat Shock Protein(Hsp40)Gene and Its Chromosomal Localization to 19p13.2." Genomics. 38巻. 446-449 (1996)
• [Publications] Yasushi Taniguchi: "Cloning,Sequencing,and Chromosomal Localization of Two Tandemly Arranged Human Pseudogenes for the Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)." Mammalian Genome. 7巻. 906-908 (1996)
• [Publications] Phuoc T.Tran: "Molecular Cloning of the Human Methylthioadenosine Phosphorylase Processed Pseudogene and Localization to 3q28." Gene. (印刷中). (1997)
• [Publications] Yoshihiro Fujiwara: "Genomic Organization and Chromosomal Localization of the Human Casein Gene Family." Human Genetics. (印刷中). (1997)
• [Publications] 奥村克純: "動物ゲノムの構造と複製に関する分子細胞遺伝学的研究" 日本農芸化学会誌. 71巻. 121-127 (1997)
• [Publications] 奥村克純: "FISHによる動物細胞ゲノムの核内構造解析の現状" 生化学. 69巻(印刷中). (1997)
• [Publications] 清水信義: "ヒト染色体-分子生物学から遺伝子医学へ-" 共立出版, 356 (1996)