-リゾチームの新しい抗菌活性の作用機構に関する遺伝子工学的研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08660165
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: ヒッシャム R イブラヒム 鹿児島大学, 農学部, 講師 (90274836)
• Keywords: 卵白リゾチーム / 量体化 / 酵母発現系 / ムラミダーゼ活性 / 抗菌活性 / 構造安定性

Research Abstract

リゾチームの構造と酵素および抗菌活性との関係に関する一連の研究の過程で申請者らは、加熱変性してSS結合が1,2個切断して2量体を形成したリゾチームが、酵素活性を示さないがグラム陽性菌に対しても陰性菌に対しても抗菌活性を示すことを見い出した。熱変性したリゾチームの新規な機能は、アンフォールディングによって分子の柔軟性が増加したことに起因するのか、疎水領域の露出によるのか、あるいは2量体形成によるのかは明らかでない。そこで、この問題解明に有効なsite-specific mutagesisの手法を用いてリゾチームの変異体を、申請者らがこれまで使ってきた酵母発現系で産出させた。作成した変異リゾチームは、4つのSSの中1個を欠くもでのCysを変換したもの(Cys80→Ser,Cys94→Ala,Cys115→Ala,Cys127→Ser)および触媒中であるAsp52をSerに変換したものである。リゾチームのcDNAをM13mp19ベクター中にクロニーングし、上記5個の変異体をin vitro mutagenesis Kitを使って作った。シークエンスキットで変異体の確認を行い、変異cDNAフラグメントを切だし、酵母発現系ベクターpYG-100のSal Iにクローンした。制限酵母マッピイング分析により変異cDNAの方向を確認し、出来た発現プラスミッドをS.serevisiaAH22に転移し、変異リゾチームを分泌させた。現在5個の変異リゾチームを分離、精製中である。今後、変異リゾチームの酵素活性および抗菌活性を測定するとともに、CDスペクトル、蛍光スペクトル、電気泳動、表面疎水性を測定し構造変化を調べる。また、タンパク質SS結合イソメラーゼでSS結合の組み替えを行ったものおよび分子間架橋試薬によって2量体化したものについても、酵素活性、抗菌活性および構造解析を行う。