1997 Fiscal Year Annual Research Report
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08660401
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| Research Institution | Miyazaki University |
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Principal Investigator |
太田 一良 宮崎大学, 農学部, 助教授 (70112315)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 豊彦 宮崎大学, 農学部, 教授 (90040857)
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| Keywords | Aspergillus niger / イヌリナーゼ / イヌリン / イヌロオリゴ糖 / 遺伝子クローニング / 塩基配列 |
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| Research Abstract |
黒麹菌Aspergillus niger No.12株は多糖イヌリンを分解してイヌロオリゴ糖を生成するエンド型イヌリナーゼを細胞外に生産する。本菌株をフルクトースを炭素源とする液体培地を用いて30°Cで振とう培養し、この培養ろ液から細胞外エンド型イヌリナーゼをDEAE-アミノセルロファインおよびQ-セファロースHPによるカラムクロマトグラフィーで電気泳動的に単一に精製した。本酵素のアミノ末端がブロックされていたため、精製酵素をリシルエンドペプチダーゼ、ブロムシアン、又はV8プロテアーゼで切断後、ペプチドをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動に供した。分離されたペプチドはPVDF膜にブロッティングし、6個のペプチドについてそのアミノ酸配列をプロテイン・シークエンサーで決定した。本酵素の内部アミノ酸配列を基に合成した2種のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRでエンド型イヌリナーゼ遺伝子の一部(648bp)を増幅した。次いで、ゲノムDNAを制限酵素EcoRI、XbaI、またはHindIIIで消化し、アガロース・ゲル電気泳動で分離後、このPCR産物をプローブとしてサザン・ハイブリダイゼーションを行ったところ、3種のいずれの消化物にも2本のハイブリダイゼーション・バンドが認められた。このことから、エンド型イヌリナーゼ遺伝子は、A.niger No.12株のゲノムDNA上に2コピー存在することが示唆された。したがって、EcoRI由来の3.9kbpと5.9kbpの断片をゲルから抽出し、プラスミドpUC18にライゲーションして作成したそれぞれのライブラリーからエンド型イヌリナーゼ遺伝子を単離した。両遺伝子ともORFには介在配列は認められず、23個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む516個のアミノ酸をコードした。また、シグナルペプチドが遊離した成熟酵素には、6ヶ所のアスパラギン型糖鎖結合部位と2個のシステイン残基が存在した。本酵素遺伝子を導入した大腸菌の無細胞抽出液でイヌリナーゼ活性が認められた。さらに、既報のPenicillium purpurogenum起源の同酵素と72%の相同性を示した。
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