ホヤ胚細胞初期神経分化過程のギャップ結合-GFP融合蛋白発現による解析

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08670066
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Meiji Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 高橋 國太朗 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (10010034)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 資子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (80277730)
• Keywords: ホヤ胚2細胞誘導系 / ギャップ結合 / 神経細胞分化 / Naチャネル / 緑色蛍光蛋白(GFP) / GFP融合蛋白 / コネキシン強制発現 / Gaウェーブ

Research Abstract

胚の発生・分化には数々の細胞間相互作用が必要であり、初期胚細胞間に存在し分子量1.7kD以下の物質を透過させるギャップ結合はそうした相互作用を担う一形式であると考えられている。しかし、ギャップ結合の役割を調べる為には先ずその動態を定量的に解析することが必要である。本研究計画では、(a)ホヤ初期胚より分離した二細胞誘導系の各発生段階で、蛍光色素を用いて二細胞間のギャップ結合の変動および、ギャップ結合により伝達される同期信号としてのCa波の伝播を定量する。(b)Connexin mRNAを注入して、対照標本のギャップ結合消失時期以降に強制的に発現する。(c)ギャップ結合の発現量・発現時間と神経細胞分化の指標であるNaチャネル発現過程を比較することを目的とした。本年度の研究成果として(1)これまでの研究により蛋白燐酸化阻害剤を作用させる通常のNaチャネルの膜への集積開始時点を越えてギャップ結合が存続するとその期間だけNaチャネルの発現が遅延することがわかっている。そこで、マウスconnexin32のmRNAを通常のギャップ結合消失時間より5時間ほど前に予定神経割球に注入、色素法あるは電気生理学的にギャップ結合が機能的に存続し、同時にNaチャネルの発現が遅延することを確かめた。(2)注入したmRNAによって、内因性のギャップチャネルのほかに実際に外来性のconnexin分子が合成されて細胞間結合部に分布していること明らかにするため、connexin遺伝子にGFP(Green Fluorescent Protein)遺伝子を結合して融合蛋白を作成してホヤ胚に発現させることを計画し、まずGFPmRNAを分裂抑制ホヤ胚割球にいれて発現させることに成功した。現在、GFPギャップ結合融合蛋白クローンのmRNAの強制発現を試みている。

Research Products

• [Publications] Saitoe,M.,Inazawa,T.&TAKAHASHI,K.20GB01:Neuronal expression in cleavage-arrested ascidian blastomeres requires gap junctional uncoupling from neighbouring cells.: Journal of Physiology (Lond.). 491. 825-842 (1996)
• [Publications] 高橋 國太朗,斉藤 実,岡村 康司: "膜興奮性から見たホヤ幼生の神経細胞分化-2割球系での細胞間相互作用とチャネル分子の動態-" 生理物理. 205. 134-138 (1996)
• [Publications] 高橋 國太郎: "標準生理学4版,第2章I.興奮性膜" 医学書院, 1017 (1996)
• [Publications] 高橋國太朗、小澤瀞司、宮崎俊一: "神経・シナプス アトラスで学ぶ生理学(高田編)第3章" 丸善株式会社, 281 (1996)