ハプテンの新しい超高感度非競合測定法の開発と応用:受動喫煙者のニコチン代謝の解析

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08670154
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: 宮崎医科大学
• Principal Investigator: 橋田 誠一 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10156268)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西片 一朗 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (50253844)
• Keywords: コチニン / 非競合法 / 酵素免疫測定法 / ハプテン / ビオチン化 / 2点結合測定法

Research Abstract

コチニンは、エチレンイミンによりアミノ基を導入後ビオチン化し非競合免疫測定法により測定する。しかし、ビオチン化と同様の方法で調製したimmunogenで得られた抗体は、ビオチン化によって生じた化学構造と親和性を生じ測定の障害となっていた。
ビオチン化と抗体の調製法を検討した結果、それぞれの調製に用いる化合物の反応手順を互いに変えることにより特異性が向上することが分かった。しかし、ビオチン化の過程で生成する不要の非特異化合物が高濃度のため、低濃度(a mol)のコチニンを測定することはできなかった。そこで、この非特異化合物をカラムや抗体を用い除去することにした。
(1)抗コチニン抗体をビオチン化に用いたものと異なる化合物で調製したhemocyanin-trans-4′-carboxycotinineコンジュゲートにより免役して得られた抗体をテストしたが全く測定できなかった。
(2)アミノ基の導入、ビオチン化後、SEP-PAKカラム、さらに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、非特異化合物を除去したがコチニンは全く測定できなかった。これは過剰のエチレンイミン非特異化合物が阻害しているものと考えられた。
(3)アミノ基の導入後、疎水HPLCカラムにトラップ、溶出し、ビオチン化前に過剰の非特異化合物を除去し、ビオチン化後、(2)を行い再び過剰の非特異化合物を除去すると感度は1pmolであった。
(4)コチニンにアミノ基の導入後、HPLCカラムの代わりに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後(2)により測定すると感度は1fmolに向上した。
以上の結果より、疎水性カラムを用いるには限界があることが分かった。しかし、新たな特異性、親和性の高い抗体を用いれば、a molレベルの測定が可能である見通しを得た。