ハプテンの新しい超高感度非競合測定法の開発と応用:受動喫煙者のニコチン代謝の解析

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08670154
• Research Institution: Miyazaki Medical College
• Principal Investigator: 橋田 誠一 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10156268)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西片 一朗 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (50253844)
• Keywords: 非競合測定法 / ヘテロ2点結合酸素免疫測定法 / ハプテン / ビオチン化 / コチニン / ストレプトアビジン

Research Abstract

直接ビオチン化できる反応基(アミノ基など)を持たないハプテンの超高感度非競合イムノアッセイを開発する。ハプテンとしてコチニンをモデルとした。コチニンは、エチレンイミンによりアミノ基を導入後、ビオチン化し非競合免疫測定法により測定する。しかし、アミノ基導入やビオチン化の過程で生じる不用の非特異化合物が高濃度のため、低濃度(a mol)のコチニンを測定することはできなかった。そこで、この非特異化合物を種々のカラムや抗体を用い除去し、コチニンの非競合免疫測定法の高感度化を試みた。
(1)アミノ基の導入、ビオチン化後、SEP-PAKカラム、さらに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、非特異化合物を除去したがコチニンは全く測定できなかった。これは過剰のエチレンイミン非特異化合物が阻害しているものと考えられた。
(2)アミノ基の導入後、疎水HPLCカラムにトラップ、溶出し、ビオチン化前に過剰の非特異化合物を除去し、ビオチン化後、SEP-PAKカラム、さらに抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後に生じた非特異化合物を除去した。しかし、疎水HPLCカラムでは、非特異化合物を選択的に除去することはできず、測定感度は1pmolであった。
(3)アミノ基の導入後、HPLCカラムの代わりに、ビオチン化により生じた化学構造に親和性のある抗体を吸収して取り除いた抗体を不溶化させて調製した抗コチニン抗体不溶化固相にトラップ、溶出し、ビオチン化後(1)と同様に測定した。この吸収処理した抗コチニン抗体により非特異化合物が省かれ、測定感度は1fmolに上昇した。
以上の結果より、非特異化合物を除去するには、HPLCやSEP-PAKカラムより特異抗体が有効であることがわかった。そして、今後さらに特異性と親和性の高い抗体を用いることによって、amolレベルの測定の可能性が示された。