1996 Fiscal Year Annual Research Report
ウェルシュ菌のホスホリパーゼC遺伝子結合蛋白の機能解析
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08670308
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Kagawa Medical School |
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Principal Investigator |
岡部 昭延 香川医科大学, 医学部, 教授 (20093677)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片山 誠一 香川医科大学, 医学部, 助手 (70169473)
松下 治 香川医科大学, 医学部, 助手 (00209537)
南 純三朗 香川医科大学, 医学部, 助教授 (40157566)
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| Keywords | Clostridium perfringens / DNA結合蛋白 / 細菌の遺伝子発現 |
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| Research Abstract |
Clostridiumperfringens NCTC8237株のホスホリバーゼC遺伝子(plc)に結合する蛋白を精製した。分子量56kDaの蛋白であった。この蛋白のN末端アミノ酸残基を決定し、データベースでの検索を行ったところ、ヘム合成に関与するHemD蛋白である可能性が指摘された。決定されたアミノ酸配列に対応する混合プライマーを用いてPCRを行い、得られたDNA断片と染色体DNAを用いてハイブリダイゼーションを行い、特異的な断片をpUC19にクローン化し、その塩基配列を決定した。予想通り、HemDをコードする遺伝子(hemD)であることが明らかとなった。この遺伝子はHemA,HemBなどとともにオペロンを形成しているため、それら全てを含む断片を大腸菌-C.perfringensのシャトルベクターにクローン化し、C,perfringens strain13に移入した。形質転換菌におけるhemDの発現は十分であることをノーザン・ブロティングにより確認された。strain13の菌体の抽出物中にはplc結合蛋白は見られず、形質転換菌の抽出物でplc結合活性が見られれば、HemDがplc結合蛋白ということになる。しかし、得られた結果は否定的であった。従って、HemD蛋白には偶然同じ分子量の別のマイナ-な蛋白が共存して、それがplc結合蛋白であると考えられる。別のアプローチとして、結合蛋白の結合領域をより詳細に検討したところ、二つの結合領域が特定された。そのうち一つにはfnr(fumarate-nitrate reductaseの遺伝子発現を調節する蛋白が特異的に作用する部位としてある種の細菌で決定されている)のコンセンサス配列と考えられる配列が存在することが明らかとなった。現在この領域のDNAを用いたアフィニティークロマトグラフィーで結合蛋白の精製を試みるとともに、fnr遺伝子のクローニングの前段階としてnitrate reductaseの存在を確認しその塩基配列を決定したところである。
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