癌の放射線感受性の分子メカニズムの解明とその臨床応用

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08671043
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 坂田 耕一 札幌医科大学, 医学部, 講師 (10235153)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森田 和夫 札幌医科大学, 医学部, 教授 (20045347) ; 晴山 雅人 札幌医科大学, 医学部, 助教授 (10173098)
• Keywords: DNA-PK / 放射線感受性 / スフェロイド

Research Abstract

1まず、異なる放射線感受性を持つ2種の細胞のDNA-PK(DNA依存性プロテインキナーゼ)活性を測定した。悪性リンパ腫(Reticulum cell sarcoma)細胞HK-1と甲状腺癌細胞Suzukiを用いた。Suzuki細胞のほうが、HK-1細胞より、放射線感受性が高いが、DNA-PK活性は、Suzuki細胞のほうが2.3x10-2pmol/μg、HK-1細胞が5.7x10-2pmol/μgと、あまり差が見られなかった。
2骨肉腫細胞(MG-63)を用いて、直径100μmの小さなSpheroidを作成し、DNA-PK活性がspheroid培養で変化するかどうかを調べた。MG-63細胞は、単層培養の状態で照射された場合に比し、3次元的なcell-to-cell contactを有するspheroid培養の状態で照射されたほうが、放射線抵抗性となる。対照として、対数増殖期(log phase)とconfluent phaseの単層培養のMG-63細胞を用いた。DNA-PK活性の測定法としては、3段階のカラムクロマトグラフィー(DEAE BIO-GELAを2回、DNA-cellulose)を行うことにより精製し、リン酸化活性の測定を行う直接法と精製を行わず、温度ショックで細胞を破壊してそのリン酸化活性を測定するpull-down法の2法を用いて測定した。しかし、直接法、pull-down法いずれの測定法でも、spheroid培養、log phaseとconfluent phaseの単層培養のMG-63細胞間をDNA-PK活性に、あまり差が見られなかった。
3DNA-PKの免疫組織染色を行うために必要な単クローン抗体を作成するため、DNA-PKの触媒機能を担う分子量460kDaのポリペプチド(p460)に対する7種のcDNAクローンの供与を英国ケンブリッジ大学より受け、現在、それを用いて、単クローン抗体を作成中である。