プロテインキナーゼC分子群の遺伝子構造変異体による分泌制御機構の解析

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08671199
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 秋田 朗子 財団法人 東京都臨床医学総合研究所, 遺伝情報研究部門, 研究員 (40124432)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大野 茂男 横浜市立大学, 医学部, 教授 (10142027) ; 矢島 由紀子 財団法人 東京都臨床医学総合研究所, 遺伝情報研究部門, 研究員 (60090114)
• Keywords: プロテインキナーゼC / ホルモン / 分泌 / ホルボールエステル / 細胞内情報伝達 / 脳下垂体培養細胞 / リン酸化 / thyrotropin-releasing hormone

Research Abstract

プロテインキナーゼC(PKC)は、種々のペプチドホルモンや神経伝達物質の分泌制御に深く関与している蛋白質リン酸化酵素であり、現在11種類の分子種が存在する。我々は、ラット脳下垂体由来のGH細胞をホルモン分泌のモデル系として、TRH刺激によるイノシトールリン脂質(PI)代謝系を介するプロラクチン(PRL)分泌過程に、PKCのε分子種が必須の役割を果たしていることを既に証明した。本研究では、GH細胞のホルモン分泌系を用いて更に分子生物学的に解析し、種々の刺激情報伝達系に介在するPKC分子の分泌制御機構について解明することを目的とする。
平成8年度は、まず、解析系を確立するために、GH細胞に内在している6種類のPKC分子種の内、α、βII、ε、δについて、その構造を改変した種々のcDNA変異体(異種間キメラ、欠失、点突然変異体等)を作成し、これらを細胞に強制発現させてPRL分泌動態および遺伝子転写活性化能を解析した。その結果、いくつかのPKC分子種について、恒常的に特定のPKC活性を増幅する系、および、内在する野生型PKCの活性をドミナントネガチイブに抑制する系について開発することができた。他方、PKC活性化以降の作用機構を明らかにするために、細胞をin vivoラベルしてホルボールエステルまたはTRH刺激によってリン酸化レベルの上昇する蛋白質を二次元電気泳動法により探索したところ、数種類の蛋白質のレベルが上昇した。これらは、PKCインヒビターによって抑制されたことからPKC活性化の下流にあると考えられる。更に、PKCεを高発現したGH細胞株を樹立して対照株と比較検討し、上記の蛋白質の内でPKCεの特異的基質である可能性の強い2種類の蛋白質を特定した。これらが何であるかについて、現在、部分アミノ酸配列の決定等により同定することを試みている。

Research Products

• [Publications] Kadota,T.et.al: "Expression of dopamin transporter at the tips of growing neurites of PC12.cells." J.Histochem.Cytochem.44. 969-996 (1996)
• [Publications] Yoshida,K.,et.al: "Translocation of protein kinase C insoforms in ischemic rat heat." Biochem.Biophys.Acta. 1317. 36-44 (1996)
• [Publications] Ono,T.et.al.: "Up-regulation of protein kinase C isozymes upon induction of apoptosis in cerebellar granule neurons." Neurosci.Res.20. 155 (1996)
• [Publications] Pickett,C.A.et.al.: "Role of specific PKC isozymes in EGF-,TRH-,and TPA-mediated rPRL gene transcription in the GH4 pituitary cell." Endocrinology. (in press). (1997)