消化器癌悪性度の定量的指標としての染色体核内分布解析の試み-in situ PCR法/FISH法のシグナルに画像解析法を応用して-

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08671471
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 糸井 啓純 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (80203123)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山岸 久一 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (40128723) ; 久保 速三 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (20225189)
• Keywords: in situ PCR / 消化器癌 / 画像解析法 / 腫瘍増殖

Research Abstract

初年度(平成8年度)はin situ PCR用のサーマルサイクラ-を導入し、まず細胞単離塗沫標本で特定の遺伝子領域を増幅ならびに可視化を主眼とした。すなわち以下に述べるin situ PCRの諸条件設定の確立が主体となった。
(1)標本の前処置: in situ PCRで用いる標本はprimer・dNTP・DNA polymerase等の目的部位への浸透性を有し、かつ増幅産物の拡散を妨げる適度な有孔性を有する必要があり、proteinase K・HCl・pepsinのそれぞれを用いて蛋白の除去の最適条件を決定した。
(2)プライマーの設定:増幅産物が局所に留まるための諸条件設定に、増幅領域を3箇所に設定して行った.すなわちp53遺伝子の1) Exon 4を含む領域(長さ293bp) 2) Exon 7を含む領域(長さ139bp) 3) Exon 4-9を含む領域(長さ2.9kb)とした。
(3) PCR条件の設定に対象として臨床的にも意義深く、通常のPCRで安定した結果の得られているp53遺伝子を用いた。
(3) PCR条件の設定:末梢血正常リンパ球の塗沫標本を用いて、5回・20回・40回の反応サイクルでそれぞれin situ PCRを行った。
実験においては増幅産物内に標識物質を直接取り込ませるため(direct法)、dNTP mixture内の標識物質としてBiotin-14-dATPを用いた。
結果
標本の前処置は、予備実験で良好な反応(PCR)が得られた.増幅領域の設定に関しては短い領域の増幅は良好な反応が得られたが、長い領域の増幅はシグナルを確認できなかった.PCR条件に関しては、5回では核内の特定箇所に集積する形で弱いシグナルを確認できたのに対して、20回・40回では核内に均一にシグナルを認めた。