先天性水頭症の発生機序解明に関する分子生物学的研究と遺伝子治療の開発に関する研究

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08671616
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 佐藤 潔 順天堂大学, 医学部, 教授 (10112707)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮嶋 雅一 順天堂大学, 医学部, 助手 (60200177) ; 新井 一 順天堂大学, 医学部, 助教授 (70167229)
• Keywords: CNP / 水頭症 / アストロサイト / cGMP / 細胞内Ca / 細胞容積

Research Abstract

(1)培養細胞を用いたCNPに対する細胞内のcGMPの定量
実験動物:水頭症発現及び非発現先天性水頭症ラットHTXを実験に用いた。また、対照動物としてWisterラットを用いた。方法:胎生17日齢のラットよりBrewerらの方法に準じて神経細胞を、生後1日齢のラットよりアストロサイトをそれぞれ培養し、各濃度(10^<-4>・10^<-9>M)のCNPを作用させた時の細胞内cGMP濃度をenzymeimmunoassay法で測定した。結果:水頭症ラットより培養したアストロサイトと対照ラットより培養したアストロサイトはともに添加したCNP濃度に比例して細胞内cGMP濃度の増加を認めた。一方、神経細胞の細胞内cGMP濃度はCNPの影響を全く受けなかった。
(2)CNP添加後の培養アストロサイトの細胞容積変化と細胞内カルシウムの測定
方法:培養アストロサイトを用いて、CNP添加後の変化を蛍光色素Fura2とCCDカメラを用いて測定した。対照として、clearance receptorのみに作用するANP analogを添加した。結果:CNP添加後2峯性の|Ca^<2+>|iの上昇を認めた。すなわち1μMのCNPを添加後、1分以内に一過性に|Ca^<2+>|iは50nMより100-200nMへ上昇し、速やかに静止レベルまで下降した。その後15-20分後に再度100-400nMまで上昇し、しかもoscillationを伴い推移した。細胞容積は添加5分後より増加し初め、添加後30分で最大になり、次第に減少した。Creceptorのみに反応する|Des-Cys^<105>,Cys^<121>|-ANPを添加すると、初めの一過性|Ca^<2+>|i上昇のみ認められ、|Ca^<2+>|iの再上昇は認められなかった。考察:以上の実験結果より、CNPはアストロサイトにあるGC-B receptorを介して、水と電解質の調節に関与している事が明らかになった。さらに、アストロサイトが脳の水と電解質のホメオスタシスに大きく関与している事を考慮に入れると、CNPは脳の水と電解質を調節する重要なホルモンであると推定される。