1996 Fiscal Year Annual Research Report
プロスタグランジンD合成酵素の立体構造決定と反応機構の解明
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08680650
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Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
大久保 忠恭 北陸先端科学技術大学院大学, 新素材センター, 助教授 (90272997)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
裏出 良博 大阪バイオサイエンス研究所, 第2研究部, 副部長(研究職) (10201360)
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| Keywords | NMR / プロスタグランジンD合成酵素 |
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| Research Abstract |
プロスタグランジンD合成酵素(PGDS)はプロスタグランジンH_2からプロスタグランジンD_2への異性化を触媒し、睡眠等の脳内活動の制御に関与する重要な酵素である。しかしながら、9,11-エピジオキシ基に特異的に作用するという興味深い性質を持つにも関わらず、その反応機構は解明されていない。そこで、本研究ではNMRを用いた溶液中の立体構造決定によりPGDSの反応機構を解明することを目的として、試料の大量発現系の構築等を行った。NMR測定に必要な20-40mgの試料を効率的かつ経済的に得るために、1-2Lの大腸菌培養でNMR測定に必要な量を確保出来るようにした。既にPGDSのcDNAはラットより純化DNAの形で単離され、大腸菌K2株の誘導体JM109をベクターとしてプラスミドpUC119に組み込まれている。培養条件、精製条件の検討を行いLB培地及びM9最小培地で目的蛋白質10mg/L-20mg/L以上の収量を達成した。そして、M9最小培地で大腸菌の栄養源に^<13>Cラベル化グルコース、^<15>Nラベル化塩化アンモニウムを用いて産出される蛋白質を100%NMR観測可能な安定同位体でラベルした。この時、ラベル化合物のコストを考慮してM9最小培地で必要なグルコース、塩化アンモニウムの量を最小限に抑えるようにした。^<15>N-^1HHMQCスペクトルではPGDSの立体構造を反映して各ピークの化学シフト値は分散していた。またβシートに特徴的な低磁場シフトしたCαHシグナルが観測された。現在、COSY、NOESY等の2次元NMRスペクトル及びNOESY-HMQC、TOCSY-HMQC等の3次元NMRスペクトルによりシグナルの帰属を行っている。
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Research Products
(6 results)
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[Publications] H.Sakashita: "Folding topology and DNA binding of the N-terminal fragment of Ada protein" FEBS Letter. 323. 252-256 (1993)
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[Publications] T.Ohkubo: "Methylation dependent functional switch mechanism newly found in the Escherichia coli Ada protein" J.Am.Chem.Soc.116. 6035-6036 (1994)
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[Publications] H.Sakashita: "Methylation dependent functional switch mechanism of the Escherichia coli Ada protein" Proc.Japan Acad.71. 198-201 (1995)
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[Publications] H.Sakashita: "Sequence-specific DNA recognition of the Escherichia coli Ada protein associated with the methylation-dependent functional switch for transcriptional regulation" J.Biochem.118. 1184-1191 (1995)
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[Publications] 大久保忠恭: "Ada蛋白質の構造と機能" 核酸化学の新展開:蛋白質核酸酵素 別冊. 40. 438-444 (1995)
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[Publications] E.H.Morita: "Implications of the zinc-finger motif found in the DNA-binding domain of the human XPA protein" Genes to Cells. 1. 437-442 (1996)
