アスパラギン結合型糖鎖遊離酵素の構造と特異性の分子進化

1997 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08680662
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 伊藤 和央 大阪市立大学, 理学部, 講師 (20183171)
• Keywords: エンド-β-N-アセチルグルコザミニダーゼHS / アスパラギン結合型糖鎖 / 糖タンパク / 上皮細胞 / ヒト口腔内上皮細胞 / ヒト唾液 / 糖鎖生物学

Research Abstract

エンドHSの従来の精製法に改良を加た。すなわち、キチンを担体とするカラムクロマトグラフィーが極めて有効で活性の損失なしに約100倍精製でき、さらにMonoQ5/5を用いるHPLCで、3つのマルチプルフォーム(MF)を完全に分離できた。これはMFの分子量は同じであるが等電点が異なっていた。改良法によるエンドHS全体の活性回収率は80%以上であった。エンドHS-II標品は約15%の純度であったが、エンドHS-IおよびエンドHS-IIは純化タンパクとして、それぞれ約67pmoleおよび240pmole精製できたが、アミノ酸部分配列の決定には不十分であった。ヒト口腔内上皮細胞におけるエンドHSの存在量は予想以上に少なく、N-末端アミノ酸配列も含めた部分アミノ酸配列の決定に必要な量のエンドHSを得るには、少なくとも5〜10リットルのヒト唾液からの口腔内上皮細胞が必要であると考えられた。一方、エンドHSの3種のMFが得られたので、タンパク部分は同一で糖鎖構造の異なる糖タンパク、糖鎖構造もタンパク構造も異なる各種糖タンパクおよび糖アスパラギンの各種糖鎖に対する作用をMF間で比較検討した結果、いずれのMFもコンプレックス型糖鎖に特異的で、糖鎖の還元末端GlcNacに結合するFucや側鎖に結合するSiaやFucおよびbiscetingGlcNAcの存在にかかわらず、2、3、4本鎖コンプレックス型糖鎖に作用た。また、ネイティブ糖タンパクや糖アスパラギンからコンプレックス型糖鎖を遊離させる一方、ハイマンノース型糖鎖や、ハイブリッド型糖鎖をもつ糖タンンパクや糖アスパラギンには作用しなかった。以上、得られた本研究結果をもとに、動物細胞がコンプレックス型糖鎖合成系を獲得し、糖タンパクにコンプレックス型糖鎖が付加されるようになると同時に、細胞の発生、分化に相応してコンプレックス型糖鎖の消長をコントロールするために必要な酵素分子として分子進化の結果、エンドHSが出現したものと推測した。

Research Products

• [Publications] 伊藤和央: "エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼHSによる糖鎖不全ヒト唾液α-アミラーゼ分子種の多様化" 応用糖質科学. 44. 223-231 (1997)
• [Publications] Ito,Kazuo: "Sugar chain deficiency of glycoproteins caused by endo-β-N-acetylgulcosaminidaseHS." GlycoconjugateJ.14. 38-38 (1997)
• [Publications] Ito,Kazuo: "Purification and evidence for the existence of three multiple forms of endo-β-N-acetylglucosaminidaseHS." J.Biol.Chem.(1998)
• [Publications] Ito,Kazuo: "Evidence for the existence of human salivary α-amylase having asparagine-linked oligosaccharides at the two potential glycosylation sites." Arch.Biochem.Biophys.(1998)
• [Publications] 南浦能至: "食品産業のためのマテリアル・イノベーション-素材開発の新展開に向けて糖修飾による酵素蛋白の安定化付与-甘藷β-アミラーゼの活性単量体の調製-" 食品化学新聞社, 307 (1997)