1997 Fiscal Year Annual Research Report
ビオチン化NADを用いたマウスリンパ球のADP-リボシル化反応の研究
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08680687
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| Research Institution | SHIMANE MEDICAL UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
土屋 美加子 島根医科大学, 医学部, 教授 (90188582)
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| Keywords | ADP-リボシル転移酵素 / ADP-リボシル化反応 / ビオチン化NAD / リンパ球 |
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| Research Abstract |
ビオチンのサクシイミド誘導体とNADのアミノヘキシル誘導体を反応させ、反応生成物をHPLCで分離し、NADに由来する254nmの波長における吸収とビオチンの競合アッセイ法によって同定されたビオチン化NAD画分を調整し、ニワトリADP-リボシル転移酵素の基質とした場合、アルギニンヘビオチンを含む部分が転移され得ることを明らかにした。さらにこの酵素によるタフトシンの修飾をニワトリ血漿でビオチン化NADを用いて検出できるか否かを検討したが不可能であった。
ビオチン化NADをマウスリンパ球の培養液に添加したのち細胞を洗浄してFITC標識アビジンで染色すると細胞が蛍光標識されるが、(1)バックグラウンドが高い、(2)酵素活性を持つ細胞と蛍光標識される細胞が必ずしも一致しないなどの問題点が生じていた。これを解決するため、マウスリンパ球に発現しているADP-リボシル転移酵素の組換え体タンパク質を作製しビオチン化NADがこの酵素の基質となり得ることを確認した。またADP-リポシルアルギニン水解酵素の処理によっても蛍光標識が低下しないことからバックグラウンドが問題であることが明らかになった。そこでバックグラウンドを低下させるために反応液や洗浄液にADP-リボースやアルブミンなど種々の物質を加える試みを行ったが、現在のところ著明な改善には至っていない。
細胞を生きたまま回収することを目的としたため比較的穏和な条件しか用いられないことがバックグラウンドを低下させられない要因であると考えられるので、細胞を固定して洗浄する、あるいは標識した細胞からビオチン化ADP-リボースと共有的に結合したタンパク質を検出するなどの方法を試みている。
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Research Products
(7 results)
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[Publications] Tsuyoshi Miyaoka: "Immunohistochemical localization of ADP-ribosylarginine hydrolase in rodent CNS" Brain Res.746. 1-9 (1997)
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[Publications] Motoi Itoga: "Nitric oxide-induced modification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with NAD^+ is not ADP-ribosylation." J.Biochem.121(6). 1041-1046 (1997)
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[Publications] Masaharu Terashima: "ADP-ribosylation of tuftsin suppresses its receptor-binding capacity and phagocytosis-stimulating activity to murine piritoneal macrophages." FEBS Lett.412. 227-232 (1997)
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[Publications] Md.Badruzzaman: "GTP-dependent modification of a 21-kDa substrate with NAD^+ in bovine brain soluble fraction is not ADP-ribosylation of small G-protein but tailing of tRNA." Biochimie. 79. 407-413 (1997)
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[Publications] S.R.Price: "Interspecies relationships among ADP-ribosylation factors(ARF) : Evidence of evolutionary pressure to maintain individual identities." Mol.Cell.Biochem.159. 15-23 (1996)
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[Publications] Mikaka Tsuchiya: "ADP-ribosylation in animal tissue" Plenum Press, 4 (1997)
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[Publications] Makoto Shimoyama: "ADP-ribosylation in animal tissue" Plenum Press, 8 (1997)
